AGE PECULIARITIES OF THE MUSCLE REGENERATION AFTER INJURY, EXPOSURE TO HE-NE LASER AND ALLOPLASTY WITH MUSCLE TISSUE FROM THE ANIMAL OF THE SAME AGE

全文:

Метод тканевой терапии, позволяющий закрывать обширные дефекты после травмы, широко применяется в регенеративной биологии и медицине [12]. В скелетных мышцах при тяжелых повреждениях формируется плотный соединительнотканный рубец [4]. Аутотрансплантация в область травмы мышечной ткани, извлеченной в момент операции из другой мышцы, улучшает регенерацию [6]. При этом дефект заполняют мышечные волокна, источником которых является имплантированная мышечная ткань. Однако в данном случае организм подвергается дополнительной травме. Пластические возможности генетически чужеродных тканей ограничены, и для длительного сохранения имплантатов требуются использование иммунодепрессантов и определенная подготовка аллоплантов. Широкое применение в области трансплантологии получило низкоинтенсивное лазерное излучение [13], которое повышает регенерационную способность тканей, снижает дегенеративные изменения после травмы, усиливает пролиферацию клеток, стимулирует неоангиогенез, в том числе за счет резервных капилляров [10]. Цель данной работы — изучить восстановление травмированных мышц у 1-месячных, взрослых и старых крыс при аллопластике области травмы мышечной тканью животного того же возраста в различных условиях предварительного лазерного облучения. Материал и методы. Исследования проведены на беспородных крысах-самцах в возрасте 1, 3–4 и 24–30 мес (по 24 животных) с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные каждой возрастной группы были разделены на 2 подгруппы. У крыс 1-й подгруппы (n=12) обе задние конечности в области проекции икроножных мышц в течение 2 нед подвергали предварительному курсовому воздействию лазерных лучей. Крыс 2-й подгруппы (n=12) не облучали. На следующий день после лазерного воздействия между подгруппами облученных и необлученных животных была проведена перекрестная аллопластика. У крыс под нембуталовым наркозом (по 0,04 г/кг) в асептических условиях разрезали кожу, кроющую мышцу и полностью перерезали только правые икроножные мышцы, сохраняя неповрежденными нервно-сосудистый пучок, лежащий на поверхности мышцы, и подлежащий малоберцовый нерв. Затем в область мышечной травмы правых икроножных мышц реципиента имплантировали измельченную мышечную ткань, извлеченную из левой икроножной мышцы донора. После операции кроющую мышцу и кожу на обеих конечностях зашивали хирургическим шелком. В результате 1-я серия опытов состояла в том, что крысам всех исследуемых возрастных групп в предварительно облученную лазером перерезанную правую икроножную мышцу имплантировали некоторое количество необлученной лазером измельченной мышечной ткани, извлеченной из левой икроножной мышцы интактной крысы-донора. Во 2-й серии опытов животным также всех возрастных групп, наоборот, в необлученную лазером перерезанную правую икроножную мышцу имплантировали облученную лазером измельченную мышечную ткань, извлеченную из левой предварительно облученной икроножной мышцы крысы-донора. Изучали только правые регенерирующие мышцы. Поскольку в каждой серии опытов одно и то же животное было и донором, и реципиентом, генетические различия у животных обеих серий, т. е. варианты тканевой несовместимости в обеих сериях, должны быть одинаковы. Условия воздействия He-Ne лазера (установка ОКГ-12, Россия): длина волны 632,8 нм, лазерный луч был расфокусирован с помощью линзы, диаметр поля облучения 2–2,5 см, плотность мощности составляла 2,5–3 мВт/см2. Облучение проводили в режиме: 10 экспозиций по 3 мин в течение 14 сут за исключением выходных дней, суммарно в дозе 4,5–5,4 Дж/см2 на каждую конечность. Регенераты правых икроножных мышц исследовали через 7, 14 и 30 сут после аллопластики. Мышцы фиксировали в смеси Карнуа, срезы толщиной 7–8 мкм окрашивали гематоксилином по Рего с докраской по Маллори. О качественных показателях восстановительного процесса в икроножных мышцах судили по изменению относительной массы регенератов (доля от массы тела), гистологической структуре восстанавливающихся мышц и количественному соотношению мышечной и соединительной тканей в 30-суточных регенератах (по площади, занимаемой этими тканями на гистологических срезах, доле от общей площади среза). Кроме того, до операции у животных всех возрастных групп — интактных и после 10 сеансов лазерного воздействия, определяли относительную массу икроножной мышцы, принимая массу животного за 100%. Поскольку в группе 1-месячных крысят последних начинали облучать лазером с 2-недельного возраста, массу икроножных мышц определяли у 2-недельных крысят и к моменту операции (к 1-месячному возрасту) без лазерного воздействия и после его завершения (n=12). В группах 3–4-месячных и 24-30-месячных крыс было изучено по 8 животных. Животных выводили из опыта инъекцией больших доз нембутала. Количественные данные обрабатывали статистически, и различия средних величин оценивали по критерию Стьюдента. Результаты исследования. 1-месячные крысята. В 1-й серии опытов через 7 сут в перерезанной икроножной мышце проксимальная и дистальная культи укорачивались, расширялись септы. Лишь единичные мышечные волокна находились в ишемическом состоянии (были темно окрашены). Область травмы была заполнена грануляционной тканью с участками жизнеспособной аллогенной мышечной ткани, в которой формировались многоядерные миотубы, наблюдались фигуры митоза в клетках, похожих на миобласты (рис. 1, а, б). Отмечалась умеренная лимфоидная инфильтрация. На периферии аллопланта встречались участки компактно расположенных параллельно ориентированных мышечных волокон с небольшим количеством миофибрилл, имеющих отчетливую поперечную исчерченность. Возможно это сохранившиеся фрагменты аллогенной мышечной ткани, пережившие состояние ишемии. По краю культей наблюдался активный рост мышечной ткани реципиента. На 14-е сутки обе культи увеличивались. Регенерационная перестройка аллогенной мышечной ткани заканчивалась. В области травмы отмечались многочисленные регенерировавшие мышечные волокна, грануляционная ткань с разветвленной сетью капилляров. От обеих культей продолжался рост мышечной ткани в сторону дефекта. Через 30 сут область травмы практически полностью заполнялась регенерирующей мышечной тканью. Во 2-й серии опытов через 7 сут также наблюдались нарушения в структуре обеих мышечных культей. Многие мышечные волокна и расширенные септы имели волнистый ход. Очагов сохранившейся аллогенной мышечной ткани было меньше, чем в 1-й серии, но в них также происходила регенерационная перестройка. Наблюдалась инфильтрация лимфоидными клетками. По краю обеих мышечных культей были видны растущие миотубы. Через 14 и 30 сут величина обеих мышечных культей и их морфологическая структура восстанавливались. В области травмы преобладали регенерирующие мышечные волокна. Встречались клетки лимфоидной ткани. Взрослые крысы (3–4-месячные). В 1-й серии опытов через 7 сут в мышечных регенератах развивался экссудативный отек тканей. При отсутствии достаточного продольного натяжения расширенные септы и многие мышечные волокна имели волнистый ход. На концах перерезанных мышечных волокон появлялись вакуоли, скапливались мышечные ядра, но роста мышечной ткани в сторону дефекта не наблюдалось. Регенерация аллогенной мышечной ткани происходила медленнее, чем у молодых крыс. Встречались еще начальные стадии регенерационной перестройки: фрагменты аллогенных мышечных волокон просветлялись, миофибриллы распадались на глыбки, лизировались, а по периферии мышечных волокон оставались клетки с крупным овальным ядром, похожие на миобласты (см. рис. 1, в). Формировались многоядерные миосимпласты, тонкие мышечные волокна (см. рис. 1, г). Были видны макрофаги, моноциты и лимфоциты. Через 14 сут структура мышечных культей восстанавливалась, хотя септы были еще расширены. Область травмы заполнялась регенерирующими мышечными волокнами и грануляционной тканью с разветвленной сетью капилляров. Усиливалась регенерация мышечной ткани реципиента. Через 30 сут область поперечной перерезки примерно на 2/3 состояла из регенерирующей мышечной ткани с умеренной лейкоцитарной инфильтрацией. Во 2-й серии опытов в течение 2 нед постепенно усиливалась регенерация аллогенной мышечной ткани и мышечной ткани реципиента. К концу наблюдения по краю культей, особенно проксимальной, отмечались плотно переплетающиеся регенерирующие толстые и тонкие мышечные волокна с повышенной лейкоцитарной инфильтрацией, что может указывать на присутствие элементов аллогенной мышечной ткани. В центре области травмы располагались тонкие регенерирующие мышечные волокна и небольшие участки рыхлой волокнистой соединительной ткани с единичными жировыми клетками. Старые крысы (24–30-месячные). Имплантация аллогенной мышечной ткани оказывала агрессивное влияние на мышечную ткань реципиента. Диаметр мышечных волокон уменьшался, пространство между ними увеличивалось. Отмечались лизис и распад миофибрилл, появление вакуолей. В результате потери некоторого количества мышечной ткани обе мышечные культи укорачивались, а область травмы значительно расширялась. Существенно замедлялся процесс регенерации аллогенной мышечной ткани. Через 7 сут в обеих сериях опытов в области травмы располагалось еще большое количество темноокрашенных фрагментов измельченной аллогенной мышечной ткани, склеенных нитями фибрина (см. рис. 1, д). По краю аллопланта появлялись нейтрофилы. На 14-е сутки в сохранившей свою жизнеспособность аллогенной мышечной ткани отмечались единичные очаги регенерирующих ориентированных в разных направлениях тонких аллогенных мышечных волокон с обильной инфильтрацией лимфоидными клетками (см. рис. 1, е). Через 30 сут область травмы была заполнена соединительной тканью с жировым перерождением и тонкими мышечными волокнами с интенсивной инфильтрацией лимфоцитами. Данные морфометрического анализа мышечных регенератов представлены на рис. 2. К концу наблюдения (30 сут) у молодых, взрослых и старых крыс в обеих сериях опытов масса мышечных регенератов была меньше, чем масса мышц до операции (P<0,01). Вместе с тем, в каждой возрастной группе в 1-й серии опытов наблюдалась тенденция к увеличению средних величин изученных показателей по сравнению с таковыми во 2-й серии. Более полным восстановление мышц при обоих условиях предварительного воздействия лазерного излучения было у 1-месячных крысят. К моменту аллопластики масса регенератов у молодых облученных крыс-реципиентов увеличивалась с 0,410±0,006 до 0,440±0,010% (P<0,01), ав 30-суточных регенератах сохранялось наибольшее количество мышечной ткани (88,0±2,4% в 1-й серии и 84,1±1,8% во 2-й серии) по сравнению с таковой у взрослых и старых животных. Обсуждение полученных данных. При имплантации необлученной лазером мышечной ткани в область травмы облученной лазером мышцы (1-я серия) и, наоборот, имплантации облученной лазером мышечной ткани в область травмы необлученной лазером мышцы (2-я серия) предварительное воздействие лазерного излучения положительно влияло на жизнеспособность аллогенной мышечной ткани и регенерацию мышечной ткани реципиента. Результаты согласуются с нашими данными, полученными ранее [1, 2]. На присутствие элементов аллогенной мышечной ткани указывала лимфоидная инфильтрация пространства между тонкими дифференцированными мышечными волокнами в области пластики 30-суточных регенератов. Не исключено формирование гибридных мышечных волокон. Аллогенные миобласты могут сливаться с регенерирующими мышечными волокнами реципиента [11, 14]. Чем моложе животное, тем выше были темпы регенерационной перестройки аллогенной мышечной ткани. Наблюдалась тенденция к увеличению массы регенератов и количества мышечной ткани в них. У старых крыс, возрастной особенностью которых является замедление темпов регенерации и снижение качественных показателей восстановленных мышц [9], положительный эффект лазерного воздействия был выражен в меньшей степени. Кроме того, в 1-й серии опытов отмечалось пролонгированное сохранение большего количества аллогенной мышечной ткани. Это указывает на возможное снижение реакции иммунной системы реципиента на трансплантацию генетически чужеродной ткани, по крайней мере, в начальные сроки регенерации. Имеются данные, что при некоторых условиях лазерное излучение может снижать активность иммунной системы [3, 5, 8]. Во 2-й серии опытов сохранение облученной лазером регенерирующей аллогенной мышечной ткани возможно определяется изменением ее иммунного статуса. Известно, что лазерное излучение может влиять на антигенность и иммуногенность тканей, свойства белков плазмолеммы лимфоцитов и их взаимодействие с чужеродной тканью [7]. Итак, предварительное воздействие излучения He-Ne лазера на мышцы реципиента или имплантируемую донорскую мышечную ткань оказывало положительное влияние на жизнеспособность мышечного аллопланта и регенерацию мышц реципиента в целом. Аллопластика мышечной тканью животного того же возраста у молодых и взрослых крыс была более эффективна, чем у старых животных.

作者简介

N. Bulyakova

RAS A. N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution

Email: bulyakova38@mail.ru

V. Azarova

RAS A. N. Severtsov Institute of Ecology and Evolution

Email: vazarova@mail.ru

参考

补充文件