PECULIARITIES OF THE REPARATIVE REGENERATION DURING THE HEALING OF ASEPTIC WOUND USING DIFFERENT METHODS OF THE SURGICAL FIELD PREPARATION OF IN THE EXPERIMENT

全文:

Позитивное влияние экзогенного монооксида азота (NO) на течение осложнённого раневого процесса послужило основанием для расширения спектра его использования, в том числе с целью профилактики послеоперационной раневой инфекции и при лечении ран огнестрельного происхождения [7, 11]. Вместе с тем, многочисленные публикации содержат настойчивые призывы к его потенцированию средствами типа антиоксидантов, фотодинамического воздействия, антибиотиков [5, 9]. В этой связи практически важным становится объективная доказательность целебных свойств экзогенного NO в превентивной хирургии. Комплексная морфологическая оценка особенностей развития раневого процесса в подобных условиях позволяет получить аргументированные ответы на вопросы о патогенетической целесообразности использования тех или иных средств в лечении асептических ран [3, 4, 8]. В связи с этим целью работы явился сравнительный анализ структурной перестройки тканей после нанесения операционной раны при использовании традиционных мер и NO-терапии для профилактики раневой инфекции. Материал и методы. Исследование выполнено на 24 белых крысах линии Вистар с исходной массой 200-250 г в возрасте от 10 до 12 мес. Эксперимент проведён в соответствии с правилами лабораторной практики (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.). Обезболивание осуществляли эндоплевральным введением тиопентал-натрия (1% раствор 1,0 мл/кг массы тела), а также использовали эфирный наркоз, прибегая к передозировке наркотического вещества при выведении животного из эксперимента. Полнослойную рану размером 30×10 мм и глубиной 2-4 мм наносили скальпелем путём рассечения тканей передней брюшной стенки. Исследовали материал, взятый из краёв раны на 1-, 3-, 5-еи 7-е сутки после её нанесения. Сравнивали результаты, полученные в 2 сериях опыта: после подготовки операционного поля по Гроссиху-Филончикову (3-кратная обработка зоны образования раневого дефекта 5% спиртовым раствором йода после сбривания волос сухим способом - I серия) и его обработки NО-содержащим газовым потоком 300 ррm, создаваемым с помощью аппарата Плазон-ВП (Центр высоких технологий при МГТУ им. Н. Э. Баумана, Россия), с экспозицией в пределах 10-15 с на 1 см2 (II серия). При морфологическом исследовании использовали методику сканирующей электронной микроскопии нативных препаратов с более детальным их изучением методом криофрактографии [1, 6, 10]. Для приготовления препаратов мягкие ткани отмывали от крови с помощью гепаринизированной среды 199, фиксировали перфузией 2,5% раствором глутаральдегида, обрабатывали 1% раствором четырехокиси осьмия и обезвоживали в этаноле восходящей концентрации. Полученные образцы замораживали в жидком азоте и раскалывали. После оттаивания в 96% этаноле препараты высушивали путем перехода через критическую точку в СО2 и напыляли золотом или платиной. Анализ препаратов проводили в сканирующем электронном микроскопе PSEM-500-х (Philips, Нидерланды) со съемкой на широко-и узкоформатную коммерческую пленку. При иммуногистохимическом исследовании фиксированные в метакарне (метанол : ингибисол : ледяная уксусная кислота=60:30:10) образцы отмывали в метаноле, хлороформе и заливали в парапласт (Polysciens Inc, США). Полутонкие срезы толщиной от 0,5 до 2 мкм получали с помощью микротома Autocut (Reichert-Jung, Австрия), депарафинировали в толуоле и регидратировали в метаноле нисходящей концентрации и воде. Затем для инактивации эндогенной пероксидазы проводили их обработку 3% перекисью водорода и промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (0,1 М при рН 7,4) с 0,05% Тwееn-20. На приготовленные срезы наносили раствор первых моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток (анти-PCNA, Fremont, США). Для уменьшения их неспецифической сорбции срезы обрабатывали 2% неиммунной сывороткой животного, от которого были получены биотинилированные антитела, и трижды промывали 0,1% раствором бычьего сывороточного альбумина (Reanаl, Венгрия) на 0,1 М ФСБ. Затем срезы обрабатывали стрептавидинбиотиновым комплексом, связанным с пероксидазой хрена (Аmersham International, Великобритания), и наносили на них хромогенный субстрат, состоящий из 1 части 3% перекиси водорода и 100 частей 0,05% раствора 3,3-диаминобензидина (Sеrvа, ФРГ) на 0,1 М ФСБ. Затем срезы промывали дистиллированной водой, докрашивали метиленовым зеленым, обезвоживали, просветляли в толуоле и заключали в бальзам (Нistomouth, Мerck, ФРГ). Полученные препараты изучали на светооптическом уровне с помощью микроскопа Биолам-И (ЛОМО, Россия). Подсчет иммунопозитивных эндотелиоцитов и клеток базального слоя эпидермиса края раны проводили в 10 полях зрения при об. 40, ок. 6 и вычисляли среднее их количество в 1 поле зрения [6, 10]. Оценку статистической значимости полученных данных проводили по t-критерию Стьюдента и считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. При традиционной профилактике хирургической инфекции иммуногистохимический анализ свидетельствовал о том, что по сравнению с результатами, полученными в 1-е сутки существования раны, в течение 3 сут эксперимента происходило постепенное увеличение числа PCNA-позитивных эндотелиоцитов до 7,62±1,4 клеток (P<0,05). В дальнейшем этот показатель возрастал более стремительными темпами до максимума на 7-е сутки заживления раны - 19,7±1,2 клеток (P<0,05; рис. 1, а). У животных, которым с превентивной целью проводили обработку операционного поля экзогенным NO, спустя 1 сут с момента нанесения раны количество иммунопозитивных эндотелиоцитов достигало 10,0±1,4. На протяжении следующих 3-5 сут число этих клеток возрастало более чем в 3 раза. К исходу недельного срока (5-, 7-е сутки) их количество приобретало устойчивый характер и держалось на уровне 29,5±1,1 клеток (см. рис. 1, а). На всех этапах исследования количество пролиферирующих эндотелиоцитов статистически значимо превышало число аналогичных клеток в ране, нанесенной при традиционной обработке кожи (P<0,05). При электронномикроскопическом исследовании было обнаружено, что раневая поверхность почти полностью покрыта слоем эндотелиальных клеток. Криофрактографически установлено, что профилактика раневой инфекции по Гроссиху - Филончикову сопровождалась низкой удельной (объёмной) плотностью кавеол на сколах эндотелиоцитов образующейся грануляционной ткани. Спустя 1 сут от начала опыта она составляла 2,9%, сокращаясь в 2 раза в течение следующих 2 сут и оставаясь далее на этом минимуме. Напротив, при превентивном использовании экзогенного NO уже в ближайшие сутки удельная плотность кавеол эндотелия кровеносных микрососудов возрастала. К 5-м суткам она достигала максимальной величины - 6,9% и в дальнейшем стабилизировалась в пределах 6,4%. Результаты сканирующей электронной микроскопии свидетельствуют о том, что независимо от способа превентивного воздействия на рану в течение 3 сут эксперимента отдельные капилляры встречались только в области дна раны, они были расширенными, базальная мембрана - разрыхлённой, а в периваскулярной зоне наблюдалось полнокровие. Далее происходило прогрессивное нарастание суммарной длины микрососудов. На фоне традиционной обработки операционного поля этот процесс характеризовался умеренным развитием капилляров. Они формировали выросты и эндотелиальные тяжи, образовавшиеся сосудистые петли располагались перпендикулярно поверхности раны. На полутонких срезах были видны признаки застоя плазмы крови в верхних петлях капиллярной сети, непосредственно под полинуклеарным валом появились «монетные» столбики из эритроцитов. Только к 7-м суткам эксперимента длина капиллярной сети достигала 104±4 мкм в 1 мм2 среза (см. рис. 1, б). В ране, которая была нанесена после обработки операционного поля NO, развитие грануляционной ткани отличалось более положительными качественными и количественными характеристиками. Уже на 3-5-е сутки была обнаружена пролиферативная активность эндотелия с интенсивным почкообразованием, что сопровождалось структуризацией капиллярной сети, протяженность которой достигала 223±10 мкм в 1 мм2. По истечении 7 сут опыта на фоне смешанного полнокровия наблюдалось активное митотическое деление эндотелиоцитов. Суммарная протяжённость микрососудистого русла вдвое увеличивалась и достигала 469±12 мкм в 1 мм2, статистически значимо отличаясь от длины капилляров, формировавшихся при традиционных мерах профилактики раневой инфекции (P<0,05; см. рис. 1, б). Пролиферативная активность клеток базального слоя эпидермиса в области нанесенной раны у животных при традиционной профилактике хирургической инфекции на протяжении 3 сут эксперимента возрастала в 2 раза, а затем также стремительно уменьшалась, вплоть до полного исчезновения PCNA-позитивных клеток. Напротив, в условиях обработки зоны нанесения раны NO-пролиферативная активность базальных клеток эпидермиса уже в 1-е сутки от начала опыта была статистически значимо выше. Своего максимума она достигала к 3-м суткам заживления раневого дефекта и сохранялась на высоком уровне до конца исследования (P<0,05; рис. 2). Обсуждение полученных данных. Результаты морфологического исследования свидетельствуют о том, что вне зависимости от используемых средств профилактики раневой инфекции в условиях экспериментального моделирования заживление хирургической раны характеризуется биологически запрограммированной последовательной сменой процессов воспаления, регенерации и эпителизации. Иммуногистохимически доказано, что предварительная обработка операционного поля с помощью аппарата «Плазон» вносит коррективы в формирование эндотелия за счет интенсивной его пролиферации. Это можно связать с потенцированием действия эндогенного (вырабатываемого в эндотелиоцитах) NO, дополнительно поступающим в ткани раны биологически активным аналогом экзогенного происхождения. В таких условиях к 7-м суткам процесс неоангиогенеза становится не только желаемым, но и объективно заметным явлением. Морфологический статус эндотелия капилляров дополняется активным развитием кавеол, которые обеспечивают эндоцитоз, а также принимают участие в регуляции сигнальных каскадов, способствуя пролиферации клеток или окончательной их дифференцировке в зависимости от типа и композиции матрикса [13-15]. Согласно теории сигналосомы посредством связи сигнальных молекул с базовой белковой структурой - кавеолином-1, кавеолы регулируют взаимодействие избранных сигнальных каскадов [13]. Криофрактографически подтверждается активное влияние экзогенного NO на этот процесс в виде значительного повышения плотности расположения кавеол на сколах эндотелиоцитов капилляров в раневой зоне. Надо полагать, усиленное образование плазмолеммальных пузырьков представляет собой стимулированное формирование дополнительных трансэндотелиальных каналов, определяющих активизацию процессов дегидратации. Интенсивное микровезикулообразование, которое связано с действием экзогенного NO, позволяет подавить воспалительную реакцию, создавая условия для активной пролиферации эндотелиоцитов и повышая скорость репаративной клеточной регенерации. По данным сканирующей электронной микроскопии, на фоне превентивной обработки операционного поля NO в ране потенцируются процессы ангиогенеза. Стремительное возрастание суммарной длины микроциркуляторного русла соотносится с активным образованием грануляционной ткани - обязательного и необходимого условия ликвидации раневого дефекта. При этом электронно-микроскопически выявлено, что вновь образованные эндотелиоциты участвуют в формировании грануляций и выстилают раневую поверхность [9]. В заживлении раны важная роль отводится эпителизации, обеспечивающей восстановление физиологически адаптированного кожного покрова в зоне повреждения. Этот процесс во многом зависит от активности клеток базального слоя эпителия, многослойный статус которого поддерживается посредством феномена межклеточного контакта в виде плотного, адгезивного (сплошного) и щелевого типа морфофункциональных проявлений. Плотные контакты обусловливают так называемое контактное торможение, сдерживая излишнее образование клеточной массы [2, 12]. При повреждении эпидермиса в ответ на возрастающую потребность в репаративной регенерации усиливается пролиферативная активность эпителиоцитов базального слоя. В силу того, что их питание осуществляется диффузно со стороны подлежащих тканей, эти процессы в ране определяются выраженностью неоангиогенеза, которая в условиях превентивной обработки кожного покрова в зоне нанесения раны NO нарастает.

作者简介

A. Larichev

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: larich-ab@mail.ru

V. Shishlo

Russian Medical Academy of Postgraduate Education

Email: kisa0303@yandex.ru

A. Lisovskiy

Yaroslavl’ Military Clinical Hospital № 1586

M. Ryabov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: mihail_ryabov@mail.ru

参考

补充文件