NEURON CONTRACTILE AND ELECTRICAL ACTIVITIES AS AFFECTED BY COLCHICINE

全文:

Как известно, сократимость в комплексе с раздражимостью является эволюционно первой реакцией проявления жизни [5]. Взаимосвязь сокращения с биоэлектрической активностью была показана Н. Н. Камия [4] на плазмодии Physarum. Первым ретракцию живого нервного волокна после его химической травмы наблюдал на головастиках лягушки C. C. Speidel [26]. В дальнейшем изучение ретракции травмированных волокон на живых животных, по-видимому, не проводилось. Последнее время двигательная активность различных типов клеток привлекает все большее внимание исследователей [2, 23, 32]. У неизмененных нейронов важным видом подвижности является сократительная активность отростков [19, 30]. Двигательные реакции нейронов, как и других типов клеток, связаны с их цитоскелетом. Получены определенные данные об участии микротрубочек в процессе сокращения отростков нервных клеток [16, 28]. Однако механизм их участия остается недостаточно изученным. Так, некоторые авторы считают, что в основе ретракции отростков лежит деполимеризация микротрубочек и F-актина [31], тогда как другие [15] — экспериментально доказывают, что при ретракции «оптовая деполимеризация микротрубочек» отсутствует. Получены также данные, которые заставляют сомневаться в том, что микротрубочки играют роль в реакции аксонов на аксотомию [29]. Поэтому мы считали необходимым на нашей модели уточнить с использованием колхицина значение деполимеризации микротрубочек на ретрактильную сократимость поврежденного отростка нейрона. Колхицин, связываясь с тубулином, препятствует его полимеризации и, таким образом, способствует разборке микротрубочек цитоскелета [1, 10]. При применении колхицина количество микротрубочек уменьшается [9]. В экспериментальных исследованиях колхицин в основном используется для изучения роли микротрубочек в исследованиях механизмов аксонального тока и связанных с ним электрических функций нейронов. Однако до сих пор остается недостаточно изученным и влияние колхицина на электрогенез нейронов. Не изучены нарушения ретракции и возможности ингибирования сокращения отростков, хотя исследования в данной области могут иметь большое фундаментальное и практическое значение для медицины. Цель настоящей работы — изучение сократительной и электрической активности нейрона под воздействием колхицина. Материал и методы. Первая серия опытов проведена на живых изолированных из ганглиев нейронах (n=50) пресноводных моллюсков (Lymnaea stagnalis, n=26 и Planorbis corneus vulgaris, n=24). Одиночные нейроны выделяли из окологлоточного ганглионарного кольца моллюска, которое вначале помещали на 40 мин в 0,4% раствор проназы, приготовленный на растворе Рингера, для удаления соединительнотканных оболочек ганглия и глиальных оболочек нейронов. Затем ганглии (n=24) помещали в раствор Рингера или в раствор колхицина с концентрацией 0,2 мг/мл (n=25) и проводили пипетирование. Изолированные таким способом нейроны помещали в микрокамеру и исследовали в фазовоконтрастном микроскопе с помощью цейтраферной компьютерной микровидеоустановки [7]. Регистрировали клетки с полностью сократившимися, частично сократившимися и несократившимися отростками. Для изучения влияния колхицина на электрогенез нейрона во второй серии опытов использовали нейроны Ретциуса медицинской пиявки (n=35). Для проведения экспериментов часть брюшной нервной цепочки из 5 первых ганглиев извлекали из тела животного. Второй ганглий за оболочки укрепляли иглами на дне экспериментальной камеры и подкрашивали 0,01% раствором нейтрального красного. В центре ганглия становились видными две крупные клетки (диаметром около 100 мкм) — нейроны Ретциуса. Остальную часть цепочки приподнимали из 1-й камеры и помещали во 2-ю камеру с вмонтированными биполярными раздражающими электродами. Раствор Рингера в 1-й камере содержал 0,2 мг/мл колхицина. Ганглий экспонировали в растворе Рингера или в растворе колхицина (0,2 мг/мл) по 40 мин. Как было показано ранее, в этих условиях применяемые агенты влияют исключительно на тело и отросток клетки [6]. Электрическую активность нейрона (в контроле — n=20, в растворе колхицина — n=15) регистрировали экстраклеточно золотым микроэлектродом в стеклянной изоляции. Синаптическую активацию осуществляли, раздражая нервную коннективу между 3-ми 4-м ганглиями толчками электрического тока длительностью 0,3 мс, силой, равной двум порогам, с частотами от 1 до 10 Гц. В контрольных опытах исследовали электрическую активность нейронов в растворе Рингера без колхицина. Все опыты проводили однотипно: cначала регистрировали фоновую импульсную активность нейрона, определяли амплитуду, длительность спайка и порог возбуждения. Затем нейрон раздражали в течение 10 мин с частотой 1–10 Гц. Результаты исследования. В растворе Рингера после изоляции среди одиночных нейронов выявлялись клетки с поврежденными отростками, которые обнаруживали способность к ретракции и оценивались как жизнеспособные. При этом сократительная активность отростков была отмечена в 92% случаев. В начале обычно происходило постепенное округление концевого отдела отростка, и далее формировалась колба ретракции, которая являлась маркером места сокращения. Скорость сокращения отростков нервных клеток резко колебалась у разных нейронов от 0,3 до 9 мкм/мин. Чаще всего отросток полностью впячивался в тело клетки. Так происходит при обычном линейном сокращении (рис. 1). Нередко сокращение отростка проявлялось своеобразным способом, когда длина оставалась неизменной, но резко уменьшалась масса его нейроплазмы, которая перемещалась в тело клетки. Отросток истончался, объем его уменьшался, т.е. наблюдалось объемное, изометрическое сокращение. Также можно было выделить смешанный тип сокращения, при котором происходило диффузное перемещение массы нейроплазмы в тело клетки с уменьшением диаметра волокна и некоторым изменением его длины. При действии колхицина на нейроны отмечалось ингибирование сокращения нервных волокон. В наших опытах блокирование микротрубочек ингибировало движение отростков у 86% нейронов (рис. 2). Из них в 45% случаев наступала полная остановка сокращения, а в 41% — отростки нейронов сокращались, но только частично. Сокращение начиналось после продолжительного латентного периода и не приводило к полному втягиванию отростка в тело клетки. Лишь у 14% нейронов отростки полностью сокращались (рис. 3). При полной блокаде ретракции не сокращались даже самые тонкие боковые ответвления инициального отростка. Колба ретракции чаще всего не образовывалась, но даже при ее формировании сокращения отростка могло не произойти. В опытах по изучению электрической активности нейрона было выявлено, что в контрольных экспериментах клетка генерировала одиночные спонтанные импульсы (рис. 4, а) частотой 0,22±0,03 имп./c. Амплитуда спонтанного спайка равнялась 46,9±0,8 мВ, длительность была равна 5,9±0,3 мс. Латентный период составлял 25,0±0,7 мс. При раздражении нейрона с частотой 1–5 Гц он отвечал одним спайком на каждый раздражающий стимул. При раздражении с частотой 7–10 Гц нейрон трансформировал частоту импульсной активности, генерируя потенциал действия не на каждый стимул раздражающего тока (4 и 3 имп./с соответственно) (рис. 5). 40-минутная инкубация ганглия в растворе колхицина вызывает изменение формы спайка (см. рис. 4, б) и повышение частоты спонтанной импульсной активности до 0,75±0,13 имп./с. Амплитуда спонтанных потенциалов уменьшается до 37,9±1,7 мВ, порог раздражения понижается на 18%, длительность спонтанного спайка увеличивается до 11,7±0,7 мс, латентный период возрастает до 37,9±1,7 мс. При раздражении нейрона с частотой 1–5 Гц, как и в контроле, нейрон отвечает одним спайком на каждый раздражающий стимул. При раздражении частотой 7 и 10 Гц нейрон отвечает более высокой частотой — 6 и 8 импульсов соответственно (см. рис. 5). Опыты продемонстрировали, что действие колхицина не вызывает блокады электрической активности нейрона Ретциуса. Увеличение частоты спонтанной импульсной активности, изменение формы спайка, а также порога раздражения нейрона и частоты ответа на высокочастотное синаптическое раздражение (7–10 Гц) свидетельствуют о том, что микротрубочки принимают участие в формировании его электровозбудимости. Обсуждение полученных данных. В результате проведенного исследования удалось показать, что колхицин способен ингибировать и полностью блокировать сократительную активность травмированных отростков нейронов при сохранении в удовлетворительном состоянии их электрической функции. Из этого следует, что при перерезке нерва можно было бы осуществить попытку частично ингибировать сокращение прерванных нервных волокон, которое увеличивает диастаз нервов, не позволяет осуществить их контактное хирургическое сопоставление и способствует развитию массивного рубца на месте перерезки. Для этого можно было бы использовать и цитохалазин В, который неплохо блокирует ретракцию [3], но это вещество является высокотоксичным. Колхицин же обладает меньшей токсичностью и давно используется как фармакологическое средство, широко применяется в медицине как антивоспалительное средство для лечения и профилактики ряда заболеваний [18, 25]. По данным литературы известно, что колхицин влияет на электрические характеристики нейрона [14]. При перфузии гигантского аксона кальмара раствором, содержащим колхицин, установлено, что для генерации Na-тока нейролеммы необходимо участие микротрубочек [20]. Разрушение колхицином микротрубочек в колоколообразной сенсилле механорецептора таракана блокирует способность рецептора отвечать на механическое раздражение [22]. Колхицин блокирует электрическую активность дендритов, тела и механорецепторов, не изменяя проводимость аксона [24]. На пресинаптических терминалях верхнего шейного ганглия кошки показано, что колхицин блокирует быстрый аксональный транспорт. Это уменьшает содержание в пресинапсе ацетилхолина, что, в свою очередь, блокирует высокочастотную активацию [27]. Препарат вызывал серьезные морфологические изменения в мотонейронах у кошки, замедляя транспорт белков, но слабо влиял на потенциал покоя и проведение спайков при антидромной стимуляции, затрагивая в большей степени ортодромное возбуждение. На культуре пирамидных нейронов гиппокампа с помощью методики пэтч-клампа показано, что колхицин влияет на регулируемую протеинкиназой С функциональную пластичность нейронов [11]. Большинство авторов связывают выявленные электрические изменения с нарушениями нейронального транспорта [9, 27]. Наши данные свидетельствуют о связи микротрубочек отростков нейронов с мембранными процессами. Возможно, эта связь осуществляется опосредованно через субкортикальную сеть актиновых филаментов [8]. Имеются указания и на прямое взаимодействие колхицина с ионными каналами [12, 13, 21]. Влияние колхицина на электрическую активность нейрона свидетельствует о сохранении в удовлетворительном состоянии электровозбудимой мембраны. Эксперименты демонстрируют, что колхицин вызывает повышение возбудимости нейрона, о чем свидетельствуют снижение порога и увеличение частоты импульсной активности. По-видимому, колхицин влияет и на функциональное состояние спайк-генерирующих ионных каналов, что приводит к изменению формы спайка и нарушению адаптации нейрона к высокочастотному синаптическому раздражению. Однако действие колхицина не имеет катастрофических последствий для электрогенеза нейронов, что подтверждает возможность его использования в качестве фармакологического препарата, способного блокировать сократительную активность поврежденных отростков нервных клеток.

作者简介

S. Sergeyeva

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

N. Vasyagina

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

O. Sotnikov

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: ossotnikov@mail.ru

T. Krasnova

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Ye. Gendina

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

参考

补充文件