Mast cells of atrophic scar dermis during exposure to vascular endothelial growth factor in experiment

全文:

ОБОСНОВАНИЕ

На сегодняшний день сложился широкий арсенал методов коррекции атрофических рубцов, таких как лазеротерапия [1], микрокристаллическая и механическая дермабразия [2, 3], однако данные методы лишь приводят к сглаживанию рельефа, не решая проблемы полностью. При этом они могут вызывать ряд побочных эффектов [4]. Эффективным решением является хирургическое вмешательство, но оно имеет ряд недостатков: травматическое воздействие на рубец может приводить к рецидиву, пациенты нуждаются в госпитализации, анестезии, подборе оптимального до- и послеоперационного лечения [5]. Наиболее популярным и востребованным методом лечения и (или) профилактики является местная терапия при помощи кремов, лосьонов, гелей, масел [6].

Цель - оценить количественные характеристики тучных клеток соединительной ткани в модели атрофического рубца при экспериментальном лечении неорганическими гелями и биокомпозитом с фактором роста эндотелия сосудов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен в соответствии с международными европейскими биоэтическими стандартами (86/609-EEC) и российскими этическими стандартами по содержанию и обращению с лабораторными животными. Эксперимент одобрен Этическим комитетом ФБОУ ВО «ЯГМУ» Минздрава России (протокол N 8 от 24.03.2016 г.). Исследование проведено на 36 самцах крыс линии Вистар, массой 200-220 г, разделенных на 6 групп, по 6 животных в каждой. 6 самцов составили группу интактных животных, без модели атрофического рубца (группа 1). У 30 оставшихся крыс, путем интрадермального введения в кожу крысы 0,2 мл раствора коллагеназы активностью 100 КЕ моделировался атрофический рубец [7]. Вторая группа была контрольной, в которой на спину животных с моделью атрофического рубца ежедневно наносился физиологический раствор. Третья, четвертая, пятая и шестая группы – экспериментальные. Спустя 7 суток после инъекции фермента на поверхность кожи этих животных ежедневно наносился исследуемый гель. Третья группа животных получала экспериментальное лечение раствором фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в фосфатном буфере. На участок кожи с атрофическим рубцом животных четвертой группы ежедневно наносился неорганический гель гидроокиси алюминия (Щелковский биокомбинат, Россия). Пятая группа животных получала экспериментальное лечение в виде неорганического геля Дерматикс (смесь полимерных кремнийорганических соединений - полисилоксаны). Шестая группа животных получала биокомпозит (VEGF в гидроокиси алюминия). VEGF добавляли к гелю гидроокиси алюминия в соотношении 20 пиколитров на 1 мл.

Все животные экспериментальных групп 3, 4, 5, 6 выводились из исследования спустя 17 дней после моделирования рубца.

Модель атрофического рубца создавалась по методике Гафарова Т.У. с соавт. [7]. В качестве рабочего раствора использована коллагеназа (ПанЭко, Москва, Россия), в разведении 500 КЕ в 1 мл. Образцы кожи фиксировали в расправленном состоянии в 10 % забуференном формалине (pH 7,4). Проводку, заливку образцов в парафин и изготовление срезов проводили по стандартным методикам. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали толуидиновым синим (ООО «МедТехникаПоинт», номер серии Lak-9270371, Россия).

Содержание тучных клеток в 1 мм² кожи определяли планиметрическим методом. Тканевые структуры, в которых тучные клетки не могли находиться в силу гистотопографических особенностей удаляли из анализа. Подсчитывали общее количество тучных клеток, а также количество недегрануллированных, частично дегранулированных и полностью дегранулированных клеток от общего количества тучных клеток (%).

На основании первичных данных каждой группы определяли: медиану (Ме), первый (Q1) и третий квартили (Q3). Различия между группами определяли при помощи критерия Данна (Dunn’s test). Статистическую обработку данных выполняли с использованием Microsoft Excel и Statistica 12.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате исследования были получены стереометрические данные об уровне дегрануляции тучных клеток в исследуемых группах (табл. 1). Тучные клетки в дерме кожи интактных крыс располагаются преимущественно группами, вдоль сосудов дермы, придатков кожи и на границе дермы и гиподермы. Единичные субэпидермальные тучные клетки встречаются редко. Однако самая большая доля полностью дегранулировавших тучных клеток отмечается при моделировании атрофического рубца без экспериментального лечения (в контрольной группе) – она достоверно больше показателей всех групп (p<0,001), за исключением 4 группы, с которой различия не достоверны. Тучные клетки соединительной ткани атрофического рубца этой группы как правило единичны и полностью дегранулированны (рис.1-а).

Численная плотность тучных клеток во всех исследуемых группах с моделью атрофического рубца была достоверно ниже чем в интактной коже: в группах 2, 4, 5 (p<0,001), в группе 3 (экспериментальное лечение VEGF, p<0,01), группе 6 (p<0,05). Самая низкая плотность тучных клеток наблюдается в группах 2 и 4, медианные значения которых не имеют межгрупповых различий. Медианные значения числа тучных клеток группы 2 (контроль) достоверно ниже чем в других экспериментальных группах (p<0,001). Больше всего тучных клеток отмечено в группах 3 и 6, и они существенно не отличаются между собой (табл.1).

Таблица 1. Количественные характеристики тучных клеток в коже у интактных и экспериментальных животных в атрофическом рубце, Me (25; 75)

Table 1. Quantitative characteristics of mast cells in skin from intact and experimental animals in atrophic scar, Me (25; 75)

Исследуемые параметры	Исследуемые группы
	1	2	3	4	5	6
Неизмененные тучные клетки, кол-во в 1 мм2	1141 (1102-1297)	142 (113-166)	667,5 (595-760)	257 (220-291)	388 (339-439)	701,5 (617-785)
Недегранулированные тучные клетки, %	51,2 (47,8-55,9)	14,5 (0-32)	45,2 (35-50)	43,1 (36-52)	8,8  (1-21)	43,6 (36-49)
Частично дегранулированные тучные клетки %	35,0 (29,7-37,7)	17,3 (11-23)	42,9 (39-48)	37,2 (30-43)	48,8 (42-56)	43,3 (37-49)
Полностью дегранулированные тучные клетки, %	14,0 (12,4-15,3)	62,8 (48-83)	11,9 (10-15)	19,2 (12-26)	37,9  (34-43)	12,5 (10-16)

Примечание: 1 – интактные животные, без модели атрофического рубца, 2 – контрольная группа с моделью атрофического рубца, 3 – экспериментальное лечение ростовым фактором эндотелия сосудов, 4 – экспериментальное лечение неорганическим гелем алюминия, 5 – экспериментальное лечение неорганическим силиконовым гелем, 6 – экспериментальное лечение биокомпозитом на основе неорганического геля алюминия и фактора роста

Note: 1 - intact animals, without atrophic scar model, 2 - control group with atrophic scar model, 3 - experimental treatment with vascular endothelial growth factor, 4 - experimental treatment with inorganic aluminum gel, 5 - experimental treatment with inorganic silicone gel, 6 - experimental treatment with biocomposite based on inorganic aluminum gel and growth factor

 

Рост числа тучных клеток в группе 5 (экспериментальное лечение силиконовым гелем) связан с увеличением доли полностью дегранулировавших тучных клеток. Их процентная доля в этой группе достоверно выше, чем во всех остальных группах с экспериментальным лечением и у интактных животных (p<0,001). При полной дегрануляции от клетки часто остается только небольшая группа метахроматичных гранул, окружающих ядро. Они редко встречаются в субэпидермальной зоне и, как правило, располагаются по одиночке. В более глубоких участках атрофического рубца также сохраняется массивная дегрануляция тучных клеток, где они располагаются малыми группами – по 2-3. (рис.1-б).

При экспериментальном лечении раствором VEGF в фосфатном буфере тучные клетки располагаются преимущественно перивазально, в большом количестве сопровождая вертикальные сосуды толщи атрофического рубца, направляющиеся к субэпидермальным слоям от глубокого сплетения кожи. Частично дегранулированные паравазальные тучные клетки располагаются группами от 3 до 8, в непосредственной близости от адвентициальной оболочки восходящих сосудов.

Рис.1. Морфологические изменения при лечении атрофического рубца кожи крысы (окраска толуидиновым синим. ув. х 40). а) полностью дегранулировавшие тучные клетки: контрольная группа с моделью атрофического рубца; б) дегрануляция тучных клеток на границе с гиподермой (экспериментальное лечение неорганическим гелем на основе полисилоксанов); в) редкие дегранулировавшие тучные клетки возле стенки сосудов на границе с гиподермой (экспериментальное лечение неорганическим гелем алюминия); г) многочисленные тучные клетки вдоль сосуда, прорастающего толщу атрофического рубца, группа с экспериментальным лечением биокомпозитом на основе неорганического геля алюминия и фактора роста; 1 – частично дегранулировавшие тучные клетки; 2 – недегранулировавшие тучные клетки; 3 – дегранулировавшие тучные клетки. Fig.1. Morphologic changes during treatment of atrophic rat skin scar (staining with toluidine blue. uv. x 40). (a) Completely degranulated mast cells: control group with atrophic scar model; b) degranulation of mast cells at the border with hypodermis (experimental treatment with polysiloxane-based inorganic gel); c) sparse degranulated mast cells near the vessel wall at the border with hypodermis (experimental treatment with inorganic aluminum gel); d) numerous mast cells along the vessel sprouting the thickness of atrophic scar, group with experimental treatment with biocomposite based on inorganic aluminum gel and growth factor; 1 - partially degranulated mast cells; 2 - non-degranulated mast cells; 3 - degranulated mast cells.

При экспериментальном лечении биокомпозитом частично дегранулировавшие тучные клетки в большом количестве располагаются непосредственно вдоль наружной адвентициальной оболочки вертикально ориентированных сосудов, проникающих в толщу дермы рубца из глубокого сосудистого сплетения (рис. 1-г). Также в большом количестве умеренно дегранулировавшие тучные клетки располагаются субэпидермально.

При дегрануляции тучные клетки высвобождают широкий спектр медиаторов. При этом часть гранул в их цитоплазме уменьшается, а в окружающих тканях встречаются секретированные гранулы [8]. Такие медиаторы как, гистамин и триптаза тучных клеток способны стимулировать дермальные фибробласты к высвобождению факторов роста, включая FGF-2 или FGF-7, соответственно [9]. Морфология, рост, подвижность, дифференцировка и даже экспрессия генов фибробластов контролируются их взаимодействием с межклеточным веществом [10], под влиянием которого фибробласты выделяют фактор стволовых клеток (SCF). Кератиноциты, также секретируя SCF, рекрутируют тучные клетки в субэпидермальный участок [11]. Это в свою очередь повышает уровень моноцитарного хемоаттрактантного протеина-1 (MCP-1), экспрессируемого и синтезируемого тучными клетками. MCP-1 в свою очередь действует на фибробласты, усиливая экспрессию мРНК коллагена α1(I) [10]. Таким образом, тучные клетки, секретируя IL-4, VEGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF), стимулируют пролиферацию фибробластов [11].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Восстановление дермы атрофического рубца под влиянием неорганических гелей связано с дегрануляцией тучных клеток. При экспериментальном лечении полисилоксанами процесс регенерации захватывает более глубокие зоны рубца, при экспериментальном лечении гидрогелем алюминия – более поверхностные зоны. При экспериментальном лечении раствором VEGF отмечается частичная дегрануляция паравазальных тучных клеток дермы. При экспериментальном лечении биокомпозитом сочетаются эффекты лечения гидрогелем алюминия и VEGF.

При экспериментальном лечении неорганическим гелем гидроокиси алюминия тучные клетки дегранулированы в основном в субэпидермальном слое. Часто можно наблюдать россыпь гранул вблизи стенки сосуда. В более глубоких слоях они также залегают по одиночке, часто рядом с сосудами (рис.1-в).

作者简介

Varvara Nikonorova

State Scientific Research Test Institute of Military Medicine of the Ministry of Defence of Russia

Email: bgnikon@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9453-4262
SPIN 代码: 2161-4838
Scopus 作者 ID: 57217099371
Researcher ID: AAI-7758-2020

junior researcher

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Ivan Gaivoronskii

Kirov Military Medical Academy; Saint Petersburg State University

Email: i.v.gaivoronsky@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7232-6419
SPIN 代码: 1898-3355
Researcher ID: А-6482-2016

MD, Dr. Sci. (Med.), professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Olga Mirgorodskaya

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: mirgolga@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0143-7402
SPIN 代码: 1523-8394

Cand. Sci. (Biol.)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Vladimir Chrishtop

Military-medical Academy

Email: chrishtop@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9267-5800
SPIN 代码: 3734-5479
Scopus 作者 ID: 57207690596
Researcher ID: J-3456-2017

MD, Cand. Sci. (Med.), principal scientist

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Aleksey A.

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова; Санкт-Петербургский государственный университет

编辑信件的主要联系方式.
Email: semfeodosia82@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1977-7536

Кандидат медицинских наук, докторант при кафедре нормальной анатомии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Доцент кафедры морфологии Санкт-Петербургского государственного университета

俄罗斯联邦

Oleg Gorbanev

National Medical Research Center named after V.A. Almazova

Email: o.v.gorbanev@mail.ru

Ассистент кафедры патологической анатомии с клиникой

俄罗斯联邦

参考

补充文件