MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF NANOLEVEL MECHANISMS THAT DETERMINE STRENGTH AND PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF BONE TISSUE

Full Text

Одна из основных функций скелета позвоночных - это обеспечение локомоторных процессов, в ходе которых преодолеваются силы гравитации [32, 45, 53, 54]. Она достигается пространственно-иерархической организацией скелета и обеспечивает биологически целесообразный уровень противодействия костных структур механическим нагрузкам, возникающим во время движения. Подтверждением этого является не только сам факт существования позвоночных в природе, но и то, что главные морфологические особенности элементов скелета (в частности, основных клеток кости - остеоцитов) от нано- до макромасштаба сохраняются уже более 80 млн лет [20]. При этом, несмотря на многолетнюю историю фундаментальных физико-химических и медико-биологических исследований костной ткани, до настоящего времени недостаточно понятны механизмы, определяющие механическую устойчивость элементов скелета на наноуровне [21, 30, 39, 40, 46-48, 51, 58, 62, 63]. Изучение механических свойств скелета в наномасштабе требует знаний структурной организации наноэлементов, участвующих в формировании костной ткани, для чего, строго говоря, необходима их квантово-механическая характеристика. Получение таких знаний невозможно без систематических исследований атомного и электронного строения, а также особенностей химического связывания атомов в наноэлементах. К сожалению, в настоящее время такие исследования практически отсутствуют, что существенно ограничивает возможности морфологического подхода к характеристике наноуровневых механизмов, определяющих механические свойства скелета. Нет также ответа на вопрос, какие методы являются наиболее перспективными для изучения этих механизмов? Цель настоящей работы - на основе данных литературы и результатов собственных исследований определить и представить морфологические характеристики механизмов, обусловливающих механические свойства костных структур в наномасштабе, наметить дальнейшие пути и методы их исследования. Теоретико-экспериментальные модели наноуровневых механизмов, определяющих механические свойства костных структур. В настоящее время существуют две основные концепции, рассматривающие механические свойства скелета на основании морфологически доказанных наноуровневых механизмов. Согласно первой [24], механические свойства костных структур определяются особенностями связей между минеральными и органическими компонентами матрикса [18, 24, 27, 35]. Согласно второй, они преимущественно детерминированы связями между минеральными компонентами, одновременно обеспечивающими формирование единого минерального массива в каждой кости (рис. ) [3, 4, 8-12]. Теоретические основы и экспериментальные доказательства механической роли наноуровневых связей между минеральными и органическими структурами кости. Согласно концепции J. D. Currey [24], жесткость и прочность костных структур определяются взаимосвязью органических и минеральных компонентов. По его мнению, кость является двухфазным материалом, подобным стекловолокну, где эпоксидная смола - аналог коллагена, а стеклянные нити - апатита. J. D. Currey отмечает, что двухфазные материалы могут функционировать эффективно только при наличии устойчивой связи между волокнами и окружающим их наполнителем. Поскольку механизм связей между коллагеном и апатитом не был до конца ясен, автор выделил два возможных варианта взаимодействия. В первом случае - это водородные связи, во втором - взаимодействие осуществляют гликозаминогликаны, действующие как цемент между коллагеном и минералом. Существенным, с нашей точки зрения, является утверждение J. D. Currey, что любая теория требует очень сильных связей между этими двумя компонентами, иначе модуль упругости кости не будет отличаться от его значений у коллагеновых фибрилл. В развитие этих взглядов D. B. Burr [18] подчеркивает, что именно минеральный компонент придает жесткость и ударную вязкость костной ткани. Фаза коллагена более эластична и определяет степень растяжимой жесткости, играя бóльшую роль в постпластической деформации кости и её полной ударной вязкости. Комбинация этих двух фаз придает костной ткани свойства, отличные от свойств каждого отдельного элемента. Эти представления широко распространены и используются, в том числе, в расчетном моделировании механических свойств костных структур на наноуровне. Так, например, I. Jager и P. Fratzl [35] показали, что с механических позиций более оптимальна ступенчатая организация минеральных частиц в фибриллах, чем строго параллельная. В этой связи важно, что в последние годы появились экспериментальные подтверждения теории J. D. Currey [24], т. е. выяснена природа «клея», обеспечивающего связь между органическими и минеральными компонентами, а также минерализованных фибрилл между собой и превращение их в единый органическо-минеральный комплекс с помощью «жертвенных связей» (sacrificial bonds) [23, 27, 57]. «Жертвенные связи». Используя атомно-силовую микроскопию, J. B. Thompson и соавт. [57] обнаружили, что при растяжении костных структур кривая деформирования коллагена на диаграмме в координатах «сила-растяжение» имеет пилообразный вид вместо плавного подъема. По мнению исследователей, такая кривая демонстрирует наличие «жертвенных связей», разрушение которых препятствует необратимой деструкции коллагеновых волокон. Как было видно из диаграммы, после прекращения действия силы исследуемые структуры возвращаются в исходное недеформированное состояние (в начальную точку диаграммы, в пределах 50 нм). Следовательно, остаточные деформации отсутствуют, и происходит полное восстановление «жертвенных связей». По данным цитируемых авторов, эта реорганизация обеспечивается ионами кальция, которые формируют мостики между двумя отрицательно заряженными ионами на молекулах коллагена, формирующих фибриллярные структуры. Аналогичные мостики могут также выстраивать и двухвалентные карбоксильные ионы в отличие от одновалентных. Таким образом, «активная длина» волокон или «скрытая длина» цепочки коллагена обеспечивает увеличение его жесткости путем разрушения и восстановления «жертвенных связей» [23, 57]. Возможно, этот же механизм влияет на вязкоупругие свойства кости и в макромасштабе [15]. В контексте изложенного крайне важны исследования G. E. Fantner и соавт. [27], которые показали, что в пространствах между соседними коллагеновыми фибриллами находятся тонкие микрофибриллярные структуры, соединяющие их в растянутом и нерастянутом состоянии. Согласно данным атомно-силовой микроскопии, силы, необходимые для разделения минерализованных фибрилл, имеют порядок наноньютона и продолжают действовать на расстоянии нескольких микрометров. По данным этих исследователей, по мере увеличения временной задержки между циклами разделения фибрилл (1, 10, 30 с) в присутствии ионов Ca2+ рассеивание энергии значительно увеличивается. Важно, что при наличии только ионов Na+ этот эффект малозначим. По мнению авторов, во время этой задержки происходит восстановление молекулярных связей между минерализованными коллагеновыми фибриллами. При этом в присутствии ионов Са2+ нити растягиваются до большей длины. Так, в Са2+-содержащем буфере при растяжении средняя максимальная длина волокон составила 2,7±0,06 мкм, а в Na+-содержащем - только 1,9±0,09 мкм. G. E. Fantner и соавт. подчеркивают, что «жертвенные связи» могут формироваться не только между органическими молекулами или между молекулами полимера и минералами, но и между кристаллитами (т. е. кристаллами, измеряемыми в микрометровом и нанометровом диапазонах) при сближении их поверхностей на расстояние менее 10 нм [27]. В этой связи, на основании данных морфологических исследований, рассмотрим вопросы пространственной организации кристаллитов в костной ткани более детально и на этой основе оценим возможность их взаимодействия между собой. Теоретические основы и экспериментальные доказательства механической роли связей между минеральными компонентами костного матрикса на наноуровне. Модель структурной организации костного минерала Ю. И. Денисова-Никольского и соавт. [8-11]. В матриксе костной ткани минералы располагаются внефибриллярно и внутрифибриллярно. Согласно этой модели (рис. ), в межфибриллярных пространствах объединения кристаллитов, прилегающие к коллагеновым фибриллам, окружают их, формируя манжетки, и контактируют с внутрифибриллярными объединениями. На отдалении от коллагеновых фибрилл кристаллиты образуют конгломераты, в которых они ориентированы в одном направлении. По отношению друг к другу эти конгломераты расположены под разными углами. Внутрифибриллярные объединения кристаллитов образуют ряд параллельных, спирально закрученных пластов, которые ориентированы под углом 8-25º к оси фибрилл. Отдельные объединения минералов связывают соседние пласты, обеспечивая непрерывность минерального компонента фибрилл, что отчетливо видно после удаления органической составляющей костной ткани. В основу данной концепции заложен принцип иерархической организации минерального компонента матрикса, в котором наименьшей морфологической единицей является кристаллит апатита. Однако ряд исследователей считают, что in situ в костной ткани минеральный матрикс не является иерархически организованной структурой, а органические молекулы просто заполняют пространство между нанокристаллитами. При этом нанокристаллиты соединены между собой органическими элементами матрикса [35, 36, 56, 60, 64]. В этой связи очень показательна модель минерализованной фибриллы, рассмотренная выше [35]. Подобные взгляды противоречат данным морфологических исследований минерального матрикса и не учитывают факт его иерархической организации [6, 9], а также возможность соединения кристаллитов через их гидратные слои (рис. , 4) [1, 4]. Это тем более важно, что любые прямые взаимодействия белок-минерал возможны только на малой части общей минеральной поверхности, доступной для гидратации [61]. Гидратный слой представляет собой насыщенный водный раствор ионов фосфата и кальция, которые структурированы в соответствии с распределением этих элементов в поверхностном слое минерала. В контексте рассматриваемой проблемы важно, что каждый кристаллит покрыт гидратным слоем [12, 43, 63]. При этом удельная поверхность минерального компонента кости составляет 240-300 м2/г, а объем связанного гидратного слоя в 1,9 раза превышает объем каждого кристаллита [12]. Исходя из представлений об иерархической организации минерального компонента матрикса, его органические компоненты могут контактировать только с кристаллитами, находящимися на поверхности минеральных пластов и конгломератов, а кристаллиты, находящиеся внутри этих минеральных образований, контактируют только между собой через гидратный слой (см. рис. , 4). Последний обеспечивает механическую связь кристаллитов между собой и их постепенное слияние в ходе роста [2, 4, 5]. Эти представления совпадают с данными G. E. Fantner и соавт., согласно которым «жертвенные связи», как было отмечено выше, могут формироваться между кристаллитами, если их поверхности сближаются на расстояние менее 10 нм [27]. Исследования гидратного слоя показали, что он представляет собой двойной слой с избытком катионов кальция, нейтрализующих заряды анионов фосфата и карбоната на поверхности кристаллита [60]. Формирование гидратного слоя обусловлено электрическим полем, образующимся вокруг минерала, в связи с асимметрией ионных групп на его поверхности. Внутри кристаллита каждый катион окружен удерживающим его полем, создаваемым анионами, и, наоборот, каждый анион окружен полем, созданным катионами. Однако на поверхности нет полной экранировки ионов. В результате поверхность раздела несет остаточные электрические заряды каждого находящегося в ней иона. Это приводит к тому, что на поверхности кристалла в виде мозаики возникает слой адсорбированных ионов с противоположным по знаку зарядом. Это, в свою очередь, ведет к уменьшению поверхностной энергии и асимметрии зарядов на поверхности раздела кристаллит-раствор путем формирования последовательных слоев поляризованных катионов и анионов, обеспечивающих электронейтральность минерального компонента матрикса. Данные слои, содержащие ионы фосфата и кальция, имеют стереометрические параметры, аналогичные параметрам решетки биоминерала [12, 60]. Подтверждением этого являются данные E. E. Wilson и соавт. [60]. Используя метод ядерно-магнитного резонанса, они показали, что 1-й слой воды на поверхности минерала костной ткани структурирован. В этом упорядоченном слое водных молекул протоны воды находятся на расстоянии примерно 0,23-0,255 нм от поверхностных атомов фосфора, и их водородные связи стабилизируют минеральную структуру. В результате этих взаимодействий водный раствор ионов фосфата и кальция, находящийся между кристаллитами, оказывает сопротивление отрыву как собственных частиц, так и кристаллитов от водной пленки [4, 5]. Следовательно, адгезивные взаимодействия соседних кристаллитов через связанные с ними гидратные слои могут лежать в основе механических свойств костных структур. Эта гипотеза требует дальнейшего подтверждения с учетом данных о силах атомно-молекулярных связей гидратных слоев двух близлежащих кристаллитов. Перспективные пути объективной оценки роли гидратного слоя в обеспечении взаимодействия кристаллитов между собой. В публикациях последних десятилетий, посвященных наноморфологии минерализованных тканей, наряду с современными микроскопическими технологиями [9, 27, 57], довольно часто используются радиационные методы [26], такие как ядерно-магнитный резонанс [38], дифракция рентгеновских лучей [33, 44] и инфракрасная Фурье- [16, 20, 25, 49, 50] и рамановская [22, 31, 42] спектроскопия. Их использование с привлечением современных теоретических подходов и методов численного моделирования [27, 35, 36] открывает дополнительные возможности в изучении морфологических характеристик костной ткани. В настоящее время разработаны неразрушающие рентгеноспектральные методики изучения строения вещества с большими потенциальными возможностями, до сих пор мало использованные в исследованиях нативной костной ткани. В первую очередь, речь идет о различных типах спектроскопий [7, 14, 17, 34, 41, 55] и рефлектометрии [28]. Их достоинствами являются точечное, «мгновенное», неразрушающее зондирование объекта [13, 14]. Современные сверхяркие источники рентгеновского синхротронного излучения позволяют измерять тонкую структуру рентгеновских спектров поглощения с высоким энергетическим разрешением, а современные методы их анализа - определять с высокой точностью локальные характеристики атомного и электронного строения: заряды атомов, межатомные расстояния, координации атомов, потенциалы межатомного взаимодействия и выявлять особенности химического связывания атомов и взаимосвязь ближнего, дальнего и сверх порядка в наноструктурах [29, 52, 55, 59]. Изложенное позволяет утверждать, что взаимодействие морфологов и физиков в этой междисциплинарной области науки позволит глубже понять детали морфологической организации и описать механические и физико-химические свойства различных компонентов скелетных тканей на наноуровне. В первую очередь, это касается исследования взаимодействия между кристаллитами и роли гидратного слоя в формировании такой сложнейшей иерархической спирально организованной структуры, какой является минеральный компонент матрикса [6, 9]. На основе этих исследований можно построить самосогласованную модель минерального компонента матрикса, которая учитывает влияния межфазовой границы «гидратный слой - кристаллит» и особенности взаимодействия органических и неорганических компонентов. Необходимость создания и использования расчетных моделей вызвана тем, что они обеспечивают получение знаний, дополняющих получаемые на экспериментальных моделях in vivo, in vitro, in situ и ex vivo [37]. Решение же задач, связанных с исследованиями in vivo, во многих случаях ограничено объективными факторами, существенно препятствующими реализации экспериментального направления. Значимость моделирования в сочетании с экспериментальными методами непрерывно возрастает и позволяет раскрывать самые загадочные проблемы в исследовании биологии кости [37]. В заключение необходимо подчеркнуть, что перспективность исследований морфологических характеристик наноуровневых механизмов заключается в том, что полученные данные могут служить фундаментальной базой для создания новых замещающих кость материалов с заданными динамическими и кинематическими характеристиками, а также управления процессами самоорганизации и механизмами ионного обмена в костной ткани.

About the authors

A. S. Avrunin

Russian R. R. Vreden Scientific Research Institute of Trauma tology and Orthopedics

Email: a_avrunin@mail.ru

A. A. Pavlychev

St. Petersburg State University

Yu. I. Denisov-Nikolskiy

Russian Institute of Medicinal and Aromatic Plants

A. A. Doktorov

Russian Institute of Medicinal and Aromatic Plants

Email: doctorovaa@mail.ru

A. S. Vinogradov

St. Petersburg State University

E. O. Filatova

St. Petersburg State University

Yu. S. Krivosenko

St. Petersburg State University

I. I. Shubnyakov

Russian R. R. Vreden Scientific Research Institute of Trauma tology and Orthopedics

References

Supplementary files