NITROXIDERGIC CELLS OF THE RAT LUNG

全文:

Оксид азота (NO) обладает высокой биологической активностью и синтезируется в организме животного и человека различными клетками при помощи фермента нитроксидсинтазы (NOS). В настоящее время идентифицированы три основных изоформы NOS, экспрессируемых в организме млекопитающих: нейрональная, индуцибельная и эндотелиальная, которые обозначаются как тип I (NOS-1, или nNOS), тип II (NOS-2, или iNOS) и тип III (NOS-3, или eNOS) согласно первичному источнику выделения: нервная ткань, макрофаги и эндотелиоциты [7, 8, 12]. Каждая изоформа кодируется собственным геном [7, 13]. Изоформы различаются первичной структурой белковой части и механизмами активации фермента. Нейрональная и макрофагальная формы NOS находятся в гиалоплазме клеток, а эндотелиальная - связана с внутриклеточными мембранными структурами [7]. Нейрональная и эндотелиальная изоформы фермента постоянно присутствуют в клетках и называются конститутивными. Индуцибельная NOS (NOS-2) появляется в клетках только через несколько часов после индукции бактериальными эндотоксинами и медиаторами воспаления [5]. В настоящее время активно изучается роль NO в регуляции функций легких в норме и при патологии. Считается, что NO участвует в важных физиологических процессах, таких как регуляция тонуса сосудов легкого, бронходилатация, сах местного воспаления и иммунной защиты [6]. Предполагается, что в респираторном тракте представлены все 3 типа NOS [7]. В эндотелии сосудов легкого синтез NO может осуществляться посредством конститутивной формы NOS. Показано, что среди нервных волокон, иннервирующих различные структуры легких, присутствуют нитроксидергические [10]. Доказано существование в макрофагах активного NO, образуемого при участии индуцибельной NOS [5, 8]. Имеются много работ, посвященных изучению функциональных особенностей различных типов NOS и связи между выработкой NO и гиперэкспрессией NOS при патологии [7, 8]. При этом сохраняется неопределенность относительно тканевых элементов, способных к синтезу NO как в норме, так и при патологии. Цель данного исследования - выявление клеток в легком, содержащих NOS, и определение их тканевой принадлежности на основании изучения структуры и локализации. Материал и методы. Исследование выполнено на беспородных крысах-самцах массой от 210 до 230 г (n=20). Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Животных выводили из эксперимента посредством декапитации под глубоким наркозом препаратами «Золитил-100» (Virbac, Франция) и «Ксила» (Interchemie, Нидерланды) с дальнейшим взятием материала для проведения гистологического исследования. Морфологическому исследованию во всех случаях подвергали левое легкое. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде, обезвоживали и заливали в парафин согласно общепринятой методике с использованием автоматической системы карусельного типа для гистологической проводки ткани, модель STP 120 (Thermo Scientific, Германия). Из полученных блоков готовили срезы толщиной 5 мкм на микротоме Leica RM2125RT (Leica, Германия), которые наклеивали на стекла с адгезивным покрытием Histobond (Marienfeld, Германия). Часть срезов окрашивали гематоксилином-эозином. В качестве положительного контроля был использован головной мозг крысы, содержащий стриатум, для которого характерно постоянное присутствие NO-ергических нейронов. После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации проводили тепловое демаскирование антигена в буфере S1700 (Dako, Дания) и блокирование эндогенной пероксидазы в 3% растворе перекиси водорода. Для блокирования неспецифических сайтов связывания антигена применяли раствор Protein block (Spring Bioscience, США). NO-ергические клетки выявляли при помощи поликлональной кроличьей сыворотки (Anti-Nitric oxidesynthase-universal, uNOS; 1:500) против общего для всех трех форм фрагмента NOS. Для выявления комплекса антиген-антитело применяли набор вторичных антител HRP Conjugate из набора Reveal Polivalent HRP DAB Detection System SPD-015 (Spring Bioscience, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения иммуноцитохимической реакции часть срезов окрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Полученные препараты исследовали под микроскопом Leica DM750 (Leica, Германия), фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Измеряли диаметр иммунопозитивных клеток и их скоплений с использованием программы LAS EZ (Leica, Германия). Результаты исследования. Анализ материала, окрашенного гематоксилином-эозином, показал, что легкие не имеют признаков патологии. Во всех исследованных случаях иммуноцитохимическая реакция прошла селективно, при слабой интенсивности фона. Специфическая реакция определялась в эпителии бронхов и по внутреннему периметру сосудов (рисунок). Отдельные окрашенные клетки и группы клеток наблюдались в респираторном отделе легкого. При большом увеличении было обнаружено, что иммунопозитивным является апикальная часть клеток многорядного реснитчатого эпителия бронхов. При этом реснички, ядро и базальная часть клеток оставались неокрашенными. Продукт иммуногистохимической реакции имел мелкогранулярный характер. Положительная реакция на NOS наблюдалась и вдоль внутренней поверхности крупных ветвей кровеносных сосудов, что соответствует расположению эндотелиоцитов в легочных венах и артериях (см. рисунок, б). Слабая реакция присутствовала в средней оболочке крупных сосудов легкого. Еще один вид иммунопозитивных клеток, характерный для всех исследованных образцов, образует компактные многоклеточные структуры, расположенные в респираторной части легкого в непосредственной близости от крупных бронхов и кровеносных сосудов. Эти иммунопозитивные клетки формировали несколько вариантов скоплений: в респираторных бронхиолах группы близко расположенных клеток численностью до 25, которые могли иметь непосредственный контакт с просветом альвеолы или располагаться в составе межальвеолярных перегородок (см. рисунок, в-г). Размеры иммунопозитивной клетки составляли от 4,5 до 14,5 мкм. Диаметр скопления клеток превышал 50 мкм. Второй вариант скоплений - когда несколько крупных отростчатых иммунопозитивных клеток были расположены отдельно друг от друга (см. рисунок, д). Максимальный размер таких клеток достигал 16,5 мкм. Третий вариант - дискретно расположенные иммунопозитивные клетки, находящиеся в составе более крупных клеточных скоплений, локализованных в периферической части долек легкого (см. рисунок, е). Размер отдельных клеток колебался от 9 до 17 мкм. Встречались и одиночные иммунопозитивные клетки, обнаруживаемые в различных отделах легкого, в том числе и в просветах альвеол. Обсуждение полученных данных. В настоящей работе для выявления нитроксидергических структур легкого у крысы был использован не применявшийся ранее подход - визуализация всех трех форм NOS с помощью одного типа антител, реагирующих с общими антигенными детерминантами изоформ фермента. Контрольные препараты подтвердили высокую селективность и специфичность использованной реакции по отношению к нейрональной форме NOS. Иммунопозитивные нейроны в контрольных срезах головного мозга были расположены в тех же зонах и относились к такому же морфологическому типу, что и нейроны, выявляемые при помощи реакции на нейрональную NOS и гистохимической реакцией на NADPH-диафоразу [1, 2, 11]. Внутренний положительный контроль (эндотелий кровеносных сосудов) показал, что использованные антитела действительно реагируют не только с нейрональной, но и с эндотелиальной формой NOS. Единичные иммунопозитивные клетки обнаружены в стенках альвеол в местах, соответствующих расположению альвеолярных макрофагов. Поэтому полученные результаты дают возможность при постановке только одной иммуноцитохимической реакции выявить все структуры легкого, способные синтезировать NO. Полученные результаты свидетельствуют о существовании NO-синтезирующих клеточных элементов в легком, относящихся к различным тканевым структурам. В крупных бронхах - это клетки в составе реснитчатого эпителия, что согласуется с данными других авторов [7, 9]. Однако в нашем исследовании показано, что NO способен синтезироваться не только в бронхах, но и в респираторных бронхиолах. В крупных кровеносных сосудах NO-ергические структуры представлены эндотелиоцитами. Средняя оболочка сосуда, дающая слабую иммунопозитивную реакцию, также является характерным местом локализации конститутивной формы NOS. Редко встречающиеся одиночные иммунопозитивные клетки на фоне многочисленных иммунонегативных в различных отделах легкого, по-видимому, представляют собой альвеолярные макрофаги. Для них характерно присутствие специфической NOS типа II [5]. Эти клетки окрашены менее интенсивно, чем другие клеточные элементы, содержащие NOS. Очевидно, это связано с тем, что были исследованы легкие интактных здоровых животных. Это подтверждает концепцию о том, что высокая экспрессия индуцибельной NOS характерна только для патологического процесса. Не менее интересны дискретно расположенные иммунопозитивные клетки в периферической части долек легкого, которые ранее не были охарактеризованы. Оказалось, что, помимо иммунопозитивных клеточных элементов в легком, обнаруженных ранее, таких как эпителиоциты бронхов [7], эндотелиоциты кровеносных сосудов [9] и альвеолярные макрофаги [5], нередко определялись скопления клеточных элементов, отличающихся как от типичных эпителиоцитов, так и от макрофагов. Отдельные компактные группы иммунопозитивных клеток напоминали нейроэпителиальные тельца [3]. Главным отличием данных компактных групп являлось не характерное место их расположения относительно бронхов, а именно локализация в составе стенки респираторных бронхиол. Несмотря на возможность существования NO-ергических нейронов в составе автономных ганглиев легкого, такие клетки в ходе настоящего исследования не были обнаружены. Таким образом, синтез NO в легком может осуществляться как клетками, тканевая принадлежность которых не вызывает сомнений (эпителиоцитами респираторного отдела легкого, эндотелием артерий и легочных вен, альвеолярными макрофагами), так и особыми NO-иммунопозитивными структурами, напоминающими по своей организации нейроэпителиальные тельца, происхождение и тканевая принадлежность которых нуждаются в специальном исследовании.

作者简介

M. Syrtsova

Institute of Experimental Medicine

Email: marina.syrczova@mail.ru

参考

补充文件