IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY OF GELATINASES AND THEIR TISSUE INHIBITORS IN BRAIN CAPILLARIES IN NORMO- AND HYPERTENSIVE RATS

Full Text

Согласно последним данным, внеклеточный матрикс участвует не только в ремоделировании клеточных образований мозга, но и в значительной степени определяет функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [1, 8, 14]. Описаны большое количество молекулярных индукторов, регуляторов и сигнальных систем, детерминирующих состояние внеклеточного матрикса, однако ведущая роль в этом процессе неизменно отводится двум группам белков: матриксным металлопротеиназам (matrix metalloproteinases, MMP) и их тканевым ингибиторам (tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMP) [5, 7]. Вызывая расщепление белка ZO-1 в эндотелии и деструкцию базальной мембраны, они повышают проницаемость ГЭБ, способствуют развитию отека и воспаления в нервной ткани [9, 15]. В настоящее время идентифицированы более тридцати представителей обширного семейства ММР, однако для некоторых из них до сих пор не определена физиологическая роль, которая может зависеть не только от вида ткани, но и от локальной экспрессии конститутивной или индуцибельной форм этих энзимов. Активность конститутивных форм ММР наиболее высока во время эмбриогенеза, но после рождения быстро снижается и остается достаточно низкой на протяжении всей жизни [4]. Экспрессия индуцибельных ММР чаще всего ассоциируется с различными процессами, требующими модификации внеклеточного матрикса, биологическое значение которого в этих случаях сводится к локализации участка поражения [1, 6]. ММР модулируют деградацию компонентов внеклеточного матрикса посредством связывания со специфическими рецепторами, экспрессия которых, в свою очередь, опосредуется рядом провоспалительных цитокинов, нейропептидов, интегринов, факторов роста и индукторов апоптоза [11, 12]. Матриксные металлопротеиназы - это универсальные эндопептидазы, среди которых желатиназы (ММР-2 и ММР-9) играют особенно важную роль в физиологических и патологических процессах в мозгу [3, 4, 13]. Все они синтезируются в виде профермента (про-ММР) и могут секретироваться в латентной форме. Активация профермента происходит с участием ряда протеаз вне клетки или на ее поверхности [12]. Представители желатиназ отвечают за деградацию коллагенов IV и V типов, эластина, фибронектина, ламинина и желатина, входящих в состав базальной мембраны капилляров и обеспечивающих механическую прочность и эластичность сосудистой стенки [11]. Концентрация желатиназ в тканях зависит как от уровня экспрессии их генов, так и активности тканевых ингибиторов - TIMP-1, в большей степени ингибирующего ММП-9, и TIMP- 2 - ММР-2 [7]. Помимо TIMP, чрезмерная экспрессия металлопротеиназ может подавляться гепарином, поступающим из тучных клеток наружной оболочки сосудов или периваскулярной ткани [2, 3], а также глюкокортикоидами, эстрогенами, прогестероном [10]. Несмотря на то, что ММР-2 и ММР-9 относятся к одному подсемейству металлопротеиназ и обладают сходной субстратной специфичностью, в организме они выполняют разные функции. При патологии активируется MMP-9, которая относится к индуцибельным ферментам [1, 8]. При поражении головного мозга усиление экспрессии ММР-9 отмечено во всех элементах, составляющих нейрососудистые единицы: эндотелиоцитах, нейронах, глии [4, 15]. ММР-2 представляет собой конститутивную форму желатиназ и, по некоторым данным, не является значимым фактором в патогенезе заболеваний нервной системы [13]. Однако при ишемическом инсульте в эндотелии капилляров коры и глиальных клетках наблюдается повышение экспрессии ММР-2 и сокращение TIMP-2 [13]. Цель настоящей работы состояла в изучении распределения ММР-2 и ММР-9, а также их тканевых ингибиторов (TIMP-2 и TIMP-1) в капиллярах головного мозга крыс при развитии реноваскулярной гипертензии. Материал и методы. Исследование проведено на половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 200-240 г с вызванной реноваскулярной гипертензией (n=35). В качестве контроля использовали ложнооперированных крыс (n=5) с нормальными показателями (108,6±4,9 мм рт. ст.) артериального давления (АД), содержащихся на стандартном рационе в одинаковых условиях лабораторного вивария. Для моделирования реноваскулярной гипертензии (РВГ) у крыс под эфирным наркозом выделяли правую и левую почки, под сосудистую ножку левой почки заводили лигатуру и перевязывали почечные артерию и вену. Правую почку прошивали восьмиобразным хирургическим швом на границе верхней и средней трети. Затем рану ушивали и проводили ее послеоперационную обработку. Крыс с РВГ изучали через 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 нед (по 5 животных в каждой группе) после операции, когда АД достигало устойчиво высокого уровня (135-168 мм рт. ст.). АД измеряли при помощи неинвазивного мониторирования кровяного давления у крыс ML U/4c501 методом хвостовой манжеты (MedLab, China). Крыс анестезировали внутрибрюшинным введением рометара (Xylazinum, Spora, Praha) в концентрации 5,5 мг/кг, после чего выводили из эксперимента путем декапитации. Головной мозг извлекали из полости черепа, фиксировали при 4 ºС в течение 4 чв 4 % растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1М натрийфосфатном буфере (рН 7,4) и заливали в парафин. Объектом исследования служили капилляры коры и прилежащего к ней белого вещества теменной доли конечного мозга. Экспериментальные манипуляции производили в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР) и Хельсинкской декларацией 1975 г., в том числе с ее пересмотренным вариантом от 2008 г. Протокол исследования был одобрен на заседании Междисциплинарного комитета по этике ГБОУ ВПО ТГМУ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23.06.2014 г. Для изучения капилляров использовали метод иммунопероксидазной реакции для выявления ММР-2, ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2. Для этих целей применяли первичные антитела anti-MMP-2 и -9 (rabbit polyclonal, ThermoScientific, rb-9234-p, 1:200, США), anti-TIMP-1 и -2 (rabbit polyclonal, Abcam, ab61224, 1:100, Великобритания), биотинилированные вторичные антитела (ThermoScientific, США), стрептавидинпероксидазу (ThermoScientific, США) и хромоген (Peroxidase Substrate Kit, Vector NovaRED, SK-4800, США). Инкубацию с первичными антителами осуществляли при 4 ºС, обработку вторичными антителами и хромогеном выполняли в соответствии с рекомендациями фирм-производителей. Для оценки специфичности реакции окрашивание отдельных срезов проводили без первичных или вторичных антител. На контрольных срезах иммунопозитивная реакция отсутствовала. Иммуногистохимическое исследование выполняли на серийных депарафинированных срезах мозга толщиной 7 мкм. Срезы монтировали таким образом, чтобы на стекле одновременно находились образцы, полученные от контрольных и экспериментальных животных каждой группы. Препараты просматривали под микроскопом AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата AxioCam ICc3 (Carl Zeiss, Германия). Об уровне экспрессии каждого из исследуемых ферментов в капиллярных сетях судили на основании удельной плотности иммунопозитивных капилляров (число фрагментов из расчета на 1 мм2) в 5 неперекрывающихся полях зрения микроскопа (об. 40) в одноименных полушариях мозга, после чего производили расчет отношения МПП-2/ТИМП-2, как это было описано ранее [5]. Для корректировки освещенности изображения использовали попиксельное вычитание снимка фона из фотографии. Количественную обработку проводили на 5 последовательных срезах каждого образца с использованием автоматизированной системы анализа изображения ImageScope (Leica, Германия). Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных при обработке образцов каждого животного. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия между средними показателями считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования. Иммуногистохимический маркер ММР-2 и TIMP-2 выявляется в капиллярах коры и белого вещества мозга как у контрольных животных (рис. 1, а, б), так и при развитии у них РВГ (см. рис. 1, в, г), ММР-9 и TIMP-1 - только у гипертензивных крыс (см. рис. 1, д-з). В иммунопозитивных сосудах преципитат откладывается в виде мелких гранул, окрашивая стенку капилляров в различные оттенки коричневого цвета. Подсчеты показывают, что у контрольных животных между капиллярами, маркированными ММР-2 и TIMP-2, не определяется значимых отличий удельной плотности ни в коре, ни в белом веществе (рис. 2, а, б), в связи с чем показатель ММР-2/TIMP-2 в соответствующих образованиях мозга колеблется около единицы (рис. 3, а). Развитие гипертензии у крыс сопровождается разнонаправленными процессами изменений количественных показателей: увеличением ММР-2 и сокращением TIMP-2 (см. рис. 2, а, б). В первые 4 нед наблюдений установлены особенно выраженные отклонения обоих показателей от контрольных цифр. В этот период на срезах теменной доли можно видеть многочисленные фрагменты ММР-2-позитивных капилляров, часть из которых, окрашенных в темно-коричневый цвет, отличаются высокой интенсивностью реакции (см. рис. 1, в). Изменения в большей степени затрагивают капилляры коры, в результате чего на 2-4-й неделе развития РВГ различия величины количественных показателей между ММР-2позитивными капиллярами коры и белого вещества достигают наиболее высокого уровня (см. рис. 2, а, б). С 6-й недели величина обоих показателей в коре и белом веществе быстро уменьшается, а начиная с 8-й недели и до конца наблюдений в большинстве случаев значимо не отличается от контроля (р>0,05). Удельная плотность среди TIMP-2-позитивных капилляров на 4-й неделе РВК сокращается до минимальных цифр, причем так же как и ММР-2, в большей степени в коре (см. рис. 2, а). В этот период в немногочисленных капиллярах, маркированных TIMP-2, определяется тонкий и рыхлый слой гранул преципитата, окрашивающий их стенку в желтоватокоричневый цвет (см. рис. 1, г). Затем число TIMP-2-позитивных капилляров увеличивается ис 8-й по 20-ю неделю РВГ с небольшими колебаниями удерживается на уровне контрольных значений (р>0,05). ММР-9-позитивные капилляры в количестве, достаточном для морфометрии, начинают выявляться на 6-й неделе РВГ, хотя большинство из них в этот период отличаются невысокой интенсивностью реакции (см. рис. 1, д). Наибольшие значения удельной плотности капилляров, содержащих ММР-9, определяются на 12-й неделе наблюдений, при этом значения обоих показателей в коре выше, чем в белом веществе (см. рис. 2, в, г). В данный период в теменной доле выявляются многочисленные иммунопозитивные капилляры, в большинстве из которых наблюдается плотное отложение продукта реакции (см. рис. 1, е). Начиная с 16-й недели, удельная плотность ММР-9-позитивных капилляров уменьшается, хотя и остается до конца наблюдений существенно выше значений, установленных на 6-й неделе РВГ (см. рис. 2, в, г). Позитивная реакция фермента в этот период определяется также в нейронах, глиальных клетках и отдельных нейтрофилах (см. рис. 1, ж). Среди капилляров, маркированных TIMP-1, наибольшая величина исследованных показателей определяется на 6-й неделе РВГ (см. рис. 2, в, г). В этот период на срезах видны многочисленные фрагменты капилляров, некоторые из которых, лежащие в проекции коры, отличаются плотным отложением продукта реакции (см. рис. 1, з). Однако, начиная с 8-й недели РВГ, удельная плотность капилляров, содержащих TIMP-1, после небольшого снижения до конца наблюдений удерживается на относительно стабильном уровне (см. рис. 2, в, г). Локальные особенности экспрессии каждого из указанных ферментов приводят к значительным колебаниям величины показателя ММР/ TIMP в капиллярах коры и белого вещества мозга в разные временные периоды развития РВГ (см. рис. 3, б). Его значения в отношении ММР-2/ TIMP-2 в капиллярах коры на 2-4-й неделе РВК превышают исходный уровень более чем в 4 раза, на 6-й - в 2,5-3 раза и лишь между 16-20-й неделями, снижаясь, достигают контрольных цифр (р>0,05). Выраженные колебания установлены и при вычислении показателя ММР-9/TIMP-1. В капиллярах коры на 12-й неделе РВГ он более чем вдвое, а на 20-й - почти в 1,5 раза превышает его значения, установленные на 6-й неделе (р<0,05). В белом веществе в соответствующие периоды развития РВГ наблюдаются также существенные (р<0,05), хотя и менее выраженные преобразования отношения ММР-9/TIMP-1 (см. рис. 3, б). Обсуждение полученных данных. Матриксные металлопротеиназы относятся к семейству цинк-и кальций-зависимых эндопептидаз, вовлекающих внеклеточный матрикс в процессы ремоделирования, т. е. деградации и протеолиза различных его компонентов [1, 4, 13]. Получено большое количество доказательств, что ряд физиологических (ангиогенез, морфогенез, возрастные преобразования нейронных и капиллярных сетей) и патологических процессов сопровождаются активацией специфических ферментов межклеточного матрикса - желатиназ [3, 15]. Разнообразные и тяжелые изменения церебральной гемодинамики, которые наблюдаются при артериальной гипертензии, могут быть обусловлены дисбалансом, возникающим между желатиназами и их тканевыми ингибиторами в мозгу, что приводит к нарушению проницаемости ГЭБ, способствует развитию отека и воспаления в нервной ткани [5, 6, 15]. Полученные нами данные показывают, что ММР-2 и TIMP-2, которые относятся к конститутивным ферментам, выявляются в капиллярах мозга у интактных и оперированных животных. Важно отметить, что в коре и белом веществе мозга у контрольных крыс удельная плотность капилляров, содержащих эти ферменты, примерно одинакова. Поэтому значения ММР-2/ TIMP-2 в том и другом случае колеблются около единицы, что свидетельствует о поддержании базового уровня обмена белков матрикса, поскольку в физиологических условиях ММР и TIMP взаимодействуют между собой в эквимолярном соотношении посредством сильной нековалентной связи [1, 4, 7]. С белками межклеточного матрикса ММР-2 взаимодействует при помощи своего фибронектиноподобного фрагмента, получая таким образом информацию о состоянии метаболизма окружающей ткани и при необходимости своевременно корректируя этот процесс. Поддержание равновесия между активностью ММР и TIMP обеспечивает нормальное функционирование сосудов. Развитие патологии, как правило, сопровождается нарушением баланса между металлопротеиназами и их ингибиторами [5, 7]. Представлены весомые доказательства прямых корреляций, существующих между уровнем экспрессии ММР и глубиной деградации матрикса [13]. По нашим данным, при гипертензии наблюдается увеличение удельной плотности ММР-2-позитивных капилляров и сокращение числа сосудов, маркированных TIMP-2. Изменения в большей степени затрагивают капилляры коры, в результате чего в первые 4 нед РВГ различия концентрации иммунопозитивных капилляров между корой и белым веществом достигают наиболее высокого уровня. Однако величина этого показателей относительно быстро возвращается к исходному уровню: уже с 8-й недели и до конца наблюдений концентрация ММР-2-и TIMP-2-позитивных капилляров как в коре, так и белом веществе, существенно не отличается от контрольных цифр. В результате этих процессов показатель ММР-2/ TIMP-2 в капиллярах коры на 2-4-й неделе РВК превышает исходный уровень более чем в 4 раза, на 6-й - в 2,5-3 раза и лишь на 16-й неделе возвращается к контрольным значениям. Соответствующие, хотя и менее выраженные изменения отношения ММР-2/TIMP-2 наблюдаются в белом веществе мозга. Дисрегуляторные процессы, возникающие в результате нарушения равновесия между металлопротеиназами и их эндогенными ингибиторами в коре и белом веществе мозга, стимулируют развитие деструктивных изменений внеклеточного матрикса, повышая вероятность неблагоприятного исхода при патологии [6, 7]. В отличие от предыдущей группы ферментов, MMP-9 и TIMP-1 в капиллярах коры и белого вещества мозга у контрольных крыс выявляются крайне редко. По-видимому, их экспрессия наблюдается лишь в сосудах с деструкцией внеклеточного матрикса, которые в небольшом количестве присутствуют и у интактных животных [8]. Обычно такие сосуды находятся в процессе реализации ремоделирования, миграции или пролиферации клеток, т.е. тех механизмов, в которых металлопротеиназы и их ингибиторы играют особенно важную роль [3, 10, 12]. Однако при развитии РВГ число капилляров, маркированных ММР-9, быстро возрастает, достигая максимальных значений на 12-й неделе после операции. В этот период выявляются многочисленные фрагменты капилляров, некоторые из которых отличаются высокой интенсивностью реакции. Чаще они находятся в проекции коры мозга. Начиная с 16-й недели РВГ, удельная плотность MMP-9-позитивных капилляров хотя и сокращается, но до конца наблюдений остается существенно выше значений, установленных на 6-й неделе РВГ. В этот период осадок, маркирующий иммунолокализацию фермента, наблюдается также в нейронах, глиальных клетках и отдельных нейтрофилах. Известно, что синтез MMP-9 всегда возрастает после повреждения мозга, а инъекции этого фермента в мозг мышей вызывают гибель клеток и воспаление нервной ткани [6]. У мышей, лишенных гена, кодирующего MMP-9, объем повреждения мозга существенно меньше, чем у мышей дикого типа. При инсульте в зоне пенумбры появляются лейкоциты, экспрессирующие ММР-9, а в плазме крови значительно повышается концентрация указанного фермента, что позволяет рассматривать его в качестве одного из важных молекулярных маркеров разрушения ГЭБ [13, 15]. Усиление деградации внеклеточного матрикса при различных заболеваниях является результатом сложного каскада реакций, в которых, помимо ММР-2 и ММР-9, участвуют многие другие металлопротеиназы (ММР-3, ММР-7, ММР- 14, МТ-ММР-1 и т.д.), действующие синергично [1, 8]. Эти протеиназы относятся к индуцируемым ферментам, синтез которых контролируется на уровне транскрипции и посттрансцеллюлярном уровне рядом ростовых факторов, провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-6, ФНО-α), нейропептидов, интегринов, индукторов апоптоза (NF-κB, AP-1, MAPK), физического и оксидантного стресса. ММР, связываясь со специфическими рецепторами, модулируют преобразования различных компонентов внеклеточного матрикса, в том числе базальных мембран капилляров, вызывая нарушение проницаемости ГЭБ и развитие инсульта - одного из наиболее частых осложнений артериальной гипертензии [4, 9]. Иная динамика прослеживается в отношении капилляров, маркированных TIMP-1, наибольшая концентрация которых определяется на 6-й неделе РВГ. В этот период на срезах видны их многочисленные фрагменты, некоторые из которых, лежащие в проекции коры, отличаются плотным отложением продукта реакции, что можно рассматривать в качестве компенсаторной реакции, направленной на подавление избыточной активности MMP-9. Фармакологическая или генетическая индукция TIMP уменьшает отек и объем деструктивных изменений нервной ткани [6]. Но уже после 8-й недели РВГ удельная плотность капилляров, содержащих маркер TIMP-1, снижается, причем быстрее в коре мозга. В результате этих процессов нарушается естественный баланс не только между ММР и TIMP, например, капилляров коры, но и между капиллярами коры и белого вещества. По данным иммуноцитохимических исследований, в капиллярах мозга MMP-9 выявляется главным образом в эндотелии и перицитах, MMP-2 - в ножках астроцитов [13]. Экспрессия MMP-9 определяется также в клетках глии, отдельных нейронах, лежащих около внутримозговых артериол и капилляров. Из этого следует, что при гипертензии страдают все элементы нейрососудистых единиц, повышая риск развития осложнений и инициируя тяжелые изменения метаболизма мозга. Таким образом, физиологические процессы обновления и восстановления внеклеточного матрикса в капиллярах обеспечивают преимущественно ММР-2 и TIMP-2, динамическое равновесие между которыми позволяет поддерживать оптимальный уровень тканевого метаболизма мозга. Значительное повышение АД индуцирует экспрессию желатиназ (в большей степени ММР-9) в капиллярах при сокращении концентрации их тканевых ингибиторов, что приводит к значительным колебаниям показателя ММР/ TIMP в разные временные периоды развития РВГ. Не исключено, что дисрегуляторные явления, возникающие в результате этих процессов, в первую очередь, в системе «ММР-9 - TIMP-1», приводят к деструктивным изменениям ГЭБ, повышая риск развития осложнений. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. М. Ч. Сбор и обработка материала: Н. В. З. Статистическая обработка данных: А. Г. Ч. Анализ и интерпретация данных: В. М. Ч., В. А. Н. Написание текста: В. М. Ч., Н. В. З. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

N. V. Zakharchuk

Pacific State Medical University

Email: zaharchuknat@mail.ru
Institute of Therapy and Instrumental Diagnostics 2 Prospekt Ostryakova, Vladivostok 690002

V. M. Chertok

Pacific State Medical University

Email: chertokv@mail.ru
Department of Human Anatomy 2 Prospekt Ostryakova, Vladivostok 690002

V. A. Nevzorova

Pacific State Medical University

Institute of Therapy and Instrumental Diagnostics 2 Prospekt Ostryakova, Vladivostok 690002

A. G. Chertok

Pacific State Medical University

Department of Human Anatomy 2 Prospekt Ostryakova, Vladivostok 690002

References

Supplementary files