CHARACTERISTICS OF SKIN HISTOGENESIS REPARATIVE AS AFFECTED BY THE METABOLITES FROM BACILLUS SUBTILIS 804 CULTURE

Full Text

Изучение проблем репаративной регенерации является одной из фундаментальных задач биологии и медицины [1, 3]. Ключевую роль в пролиферации и дифференцировке различных клеток кожи и других тканей играет группа пептидов, относящихся к фактору роста фибробластов (ФРФ) [2, 4, 5]. В 2009 г. в Оренбургской государственной медицинской академии под руководством проф. В. И. Никитенко были получены продукты жизнедеятельности бактерий штамма Bacillus subtilis 804, стимулирующие рост фибробластов (ФБ) человека в культуре. Целью настоящего исследования явилось изучение структурно-функциональных аспектов биостимулирующего влияния метаболитов культуры Bacillus subtilis 804 на процессы репаративного гистогенеза при заживлении глубоких линейных ран кожи крыс. Материалы и методы. Экспериментальные исследования проводили на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 180,0±10,0 г. Все исследования на животных были выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1984), «Хельсинкской декларацией этических принципов» (1975) и ее пересмотренным вариантом от 2008 г. Было получено одобрительное заключение локального этического комитета Оренбургского государственного медицинского университета (протокол № 82 от 20.06.2013 г.). После удаления волосяного покрова на спине животных в стерильных условиях под ингаляционным наркозом были выполнены линейные раны на коже длиной 3 см, глубиной до гиподермы. Животные были разделены на 2 группы по 20 крыс. В 1-й (подопытной) группе зону раневого дефекта кожи однократно орошали 1,0 мл стерильного раствора метаболитов культуры Bacillus subtilis 804 в дозе равной 0,015 мкг/кг массы тела крысы. Во 2-й (контрольной) группе на рану наносили 1,0 мл изотонического раствора NaCl. Животных выводили из опыта на 3-, 7-е и 11-е сутки после нанесения раны на кожу. У подопытных и контрольных животных иссекали участки кожи с послеоперационными ранами и подлежащими тканями. Кусочки тканей фиксировали в 10 % растворе формалина, забуференного по Лилли, затем обезвоживали в этаноле возрастающей крепости и заливали в целлоидин и парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 5 мкм после депарафинизации исследовали при помощи световой микроскопии с применением гистологической (окраска гематоксилином Майера и эозином), гистохимической (окраска по Маллори, толуидиновым синим), иммуногистохимической (выявление экспрессии белка Ki-67, коллагена I-III типа) методик исследования. С помощью программы оптического анализа ImageJ 1.46h по цифровым микрофотографиям проводили морфометрическую оценку эпидермиса и дермы [подсчёт объёмной плотности сосудов микроциркуляторного русла, коллагеновых волокон (КВ), аморфного вещества, клеток]. При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (ИП) по формуле: ИП=(n+/N)×100 %, где n+ - число меченых ядер, N - общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения (на микрофотографии). В ходе иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела и систему визуализации фирмы BioGenex, США. При проведении статистической обработки результатов вычисляли средние значения абсолютных и относительных величин (M), ошибки средних величин (m) и t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при р<0,05. Результаты исследования. Область раневого дефекта кожи крыс в контрольной группе на 3-и сутки характеризуется интенсивной воспалительной реакцией в фазе экссудации. На фоне массивной инфильтрации полиморфно-ядерными лейкоцитами (ПЯЛ) и интерстициального отека (что отражается в увеличении объемной плотности аморфного вещества) наблюдалось небольшое число макрофагов (МФ). Активно продолжается лейкодиапедез. Эпителизация в большинстве случаев отсутствует либо нарастающий эпителий не покрывает полностью раневой дефект кожи. На 3-и сутки в подопытной группе определяется эпителизация раны под струпом. Эпителиальный пласт достигает 2-3 слоев. Воспалительная реакция - незначительная с преобладанием отечного компонента над инфильтративным. Соотношение МФ и нейтрофилов увеличивается по сравнению с контролем и составляет 2,3:1 соответственно (таблица). Развитие грануляционной ткани (ГТ) и полное закрытие раневого дефекта эпителием наблюдали в контрольной группе на 7-е сутки. Однако наличие в ткани воспаления, недостаточная макрофагальная реакция задерживали эпителизацию, а также пролиферацию и дифференцировку ФБ. Тонкие КВ (2,8±0,2 мкм) были представлены коллагеном III типа. На 7-е сутки в подопытной группе процесс интеграции коллагеновых фибрилл продолжался, значимо нарастала (р<0,01 в сравнении с контролем) толщина КВ до 3,9±0,3 мкм. На 7-е сутки уже инициировался процесс реорганизации ГТ, выражающийся в запустевании и редукции сосудов, постепенной деградации коллагена III типа и появлении зрелого коллагена I типа. В результате значительного увеличения пролиферативной активности эпителиоцитов формировались до 6-7 слоев эпителия, что соответствовало нормальной толщине эпидермиса кожи крысы. На 11-е сутки в подопытной группе в связи с завершением формирования эпителиального пласта, дифференцирующегося на все функциональные слои, наблюдалось снижение ИП. Собственно дерма была представлена плотной волокнистой неоформленной соединительной тканью, матрикс которой содержал КВ коллагена I типа, преимущественно ориентированных вдоль ФБ и базальной мембраны в соответствии с функциональной нагрузкой на ткань. Также заметно уменьшалась средняя толщина КВ до 2,4±0,2 мкм. Морфологическая картина в контроле на 11-е сутки была сходна с таковой в опыте на 7-е, хотя и здесь можно отметить ряд отличий. Во-первых, меньшее значение ИП базальных кератиноцитов, что определяло замедление эпителизации и связано с нарушением созревания ГТ. Во-вторых, большая толщина КВ (4,1±0,4 мкм) в контроле на 11-е сутки и (3,9±0,3 мкм) в опыте на 7-е сутки. Обсуждение полученных данных. В работе дано описание с количественной оценкой изменений структурных элементов области заживления глубоких линейных ран кожи крыс на разных сроках репарации. Известно, что заживление ран зависит от выраженности воспалительной реакции [1, 3]. Более высокий макрофагально-нейтрофильный индекс в подопытной группе свидетельствует об изначально меньшей выраженности воспалительного процесса, более быстром очищении раны и переходе на следующие этапы заживления по сравнению с контрольной группой. Уже на 3-и сутки в опыте инициируется процесс образования ГТ. Фибробластический дифферон гетерогенен: наряду с юными ФБ, отмечались функционально активные формы. Благодаря синтетической деятельности ФБ состав межклеточного вещества имел концентрацию и соотношение гликозаминогликанов и гликопротеинов, необходимых для инициации процесса агрегации молекул коллагена в фибриллы, что подтверждается формированием тонких коллагеновых волокон толщиной до 2,3±0,3 мкм. Известно, что толщина волокон коллагена III типа меньше волокон коллагена I типа [5]. По нашим наблюдениям при увеличении содержания коллагена I типа в процессе заживления происходит одновременное уменьшение средней толщины КВ. Мы полагаем, что данное явление связано с преобладанием коллагенолиза коллагена III типа над синтезом коллагена I типа. Активность синтеза коллагена I типа и сборка КВ уступают деградации зрелых КВ, состоящих из коллагена III типа. Этим же можно объяснить и большую толщину КВ в контроле на 11-е сутки (4,1±0,4 мкм) по сравнению с опытом на 7-е сутки (3,9±0,3 мкм), что обусловлено менее выраженной реакцией МФ и замедлением процессов коллагенолиза уже зрелых КВ коллагена III типа. Полученные результаты соответствуют данным литературы о реорганизации соединительной ткани при репаративных процессах [1, 3]. Выводы. 1. Применение метаболитов Ba cil lus sub tilis 804 лимитирует выраженность воспалительного процесса, что определяет раннюю миграцию МФ в зону повреждения и ускоренное очищение раневого дефекта. 2. Входящие в состав метаболитов Bacillus subtilis 804 вещества стимулируют миграцию в рану фибробластов, их пролиферацию и дифференцировку, что обеспечивает формирование гетерогенного фибробластического дифферона уже на 3-и сутки после нанесения раны, а на 7-е сутки определяет перестройку грануляционной ткани с заменой беспорядочно ориентированных коллагеновых волокон, содержащих коллаген III типа, на функционально ориентированные пучки с коллагеном I типа. 3. При местном применении метаболиты Ba cillus subtilis 804 стимулируют пролиферацию эпителиоцитов, способствуя ускоренному темпу формирования функционально и морфологически полноценного эпидермального пласта уже на 7-е сутки после альтерации. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: В. А. М. Сбор и обработка материала: В. А. М, Р. А. А. Статистическая обработка данных: В. А. М, Н. Р. Б, О. Ю. С., К. В. К. Анализ и интерпретация данных: В. А. М. Написание текста: В. А. М, Р. А. А. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

About the authors

V. A. Mikhanov

Email: vmikhanov@gmail.com

R. A. Abzemeleva

N. R. Bakayeva

O. Yu. Sipailova

K. V. Korochina

References

Supplementary files