REACTIVE CHANGES OF THE RAT BRAIN CELLULAR ELEMENTS UNDER DIFFERENT CONDITIONS OF CIRCULATORY HYPOXIA

Full Text

Распространенной моделью ишемических повреждений головного мозга является перевязка обеих общих сонных артерий. В этом случае страдают все отделы мозга, но стволовые — в меньшей степени [17]. Кровоснабжение мозга поддерживается за счет двух позвоночных артерий, и животные выживают в течение 2–4 нед, если их не подвергать стрессорным воздействиям [10]. Данная модель глобальной ишемии мозга обычно используется для установления функциональных и биохимических постишемических нарушений [9, 14], важных для оценки эффективности фармакологической коррекции этих нарушений [10, 12]. Данных литературы о структурных, пространственных и количественных изменениях клеточных элементов формаций мозга при данном способе моделирования ишемии мы не нашли. Морфологические исследования глобальной ишемии мозга единичны; большей частью они связаны с зоной ишемического инфаркта и прилегающей области «полутени» (zona penumbra), образовавшимися в результате фокальной циркуляторной гипоксии. В этих зонах процесс развития постгипоксических изменений строения различных клеток мозга исследован довольно подробно [2]. Однако в большинстве экспериментальных работ отсутствует систематическое описание реактивных изменений всех основных клеточных элементов, находящихся в одинаковых условиях фокальной ишемии. Исследована, главным образом, пространственная и структурная изменчивость тел клеток амебоидной формы глии (активированных макрофагов), начинающих концентрироваться в зоне пенумбры после 3 сут острой гипоксии. Пространственная пластичность других видов глиоцитов мало изучена. Способность олигодендроцитов концентрироваться вблизи тел нейронов изучена при глобальной наркотической гипоксии [1, 6], при алкогольной абстиненции [4]; увеличение числа периваскулярных форм этих глиоцитов выявлено при хронической алкогольной интоксикации [4]. Несмотря на наличие данных о перемещениях тел астроцитов, направленных к области повреждения мозга у взрослых особей [15] и выделение периваскулярных и перинейрональных форм астроцитов, отличающихся по положению относительно стенки ближайших сосудов [2], в литературе нами не найдено работ, касающихся прицельного изучения изменчивости расстояния между астроцитами и стенкой сосудов. В единичных исследованиях лишь упомянуты наблюдения периваскулярных скоплений тел астроцитов, в частности, при иммунном воспалении [18]. Убедительные данные о дислокации тел нейронов относительно сосудистых компонентов мозга при различных воздействиях на зрелый мозг нами не найдены. Вместе с тем, феномен миграции нейронов нельзя исключить из перечня динамичных признаков гипоксии, даже исходя из данных о миграции клеток нейроглии. В целом, морфологические исследования последствий глобальной или фокальной ишемии далеко не приближаются к выявлению целостного спектра лабильных структурных, количественных и пространственных постишемических изменений основных клеточных элементов мозга, способных представлять собой совокупность критериев, верифицирующих степень повреждения мозга и морфологическую эффективность ее фармакологической коррекции. Цель настоящего исследования — выявить структурные, пространственные и количественные изменения клеточных элементов паранигрального ядра (ПНЯ) среднего мозга и переднего цингулярного поля (ПЦП) конечного мозга при различных условиях циркуляторной гипоксии. Материал и методы. Опыты выполнены на крысахсамцах линии Вистар массой 200–220 г в возрасте 4 мес, полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область). Были исследованы 2 левосторонние формации мозга, получающие кровь из разных крупных артерий [16] — переднемедиальный подотдел ПНЯ среднего мозга и V– VI слои прегенуальной части ПЦП — Cg3. Вследствие наиболее компактного расположения и крупного размера тел их нейронов данные структуры были предложены в качестве стандартных подотделов дофаминергической системы, клеточные элементы которых способны к динамичным изменениям при различных воздействиях на мозг [4–6]. Первая формация снабжается кровью из многочисленных мелких срединных среднемозговых артерий (бассейн позвоночной артерии), другая — из ветвей внутренней лобной артерии (бассейн передней мозговой артерии). Клеточные элементы ПНЯ и ПЦП были исследованы у 3 групп крыс через 3 мин после декапитации согласно «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267). Первая группа — интактные крысы (n=4) представляла собой основной контроль (контроль I). У крыс экспериментальной группы (n=4) воспроизводили неполную ишемию ПЦП. Под кратковременным эфирным наркозом производили билатеральную окклюзию обеих общих сонных артерий. Крыс фиксировали на станке, препарировали общие сонные артерии и перевязывали их. Рану обрабатывали антисептиком и послойно зашивали. Контролем для животных с ишемией (контроль II) служили ложнооперированные животные (ЛОЖ, n=4), у которых воспроизводили все этапы операции без перевязки сонных артерий. Экспериментальных и ЛОЖ умерщвляли через 7 сут после операции. Головной мозг фиксировали в 9% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин, изготавливали серийные срезы во фронтальной плоскости толщиной 3 мкм. Для исследования ПНЯ срезы делали на уровне передней границы сосцевидных тел, а V–VI слоев ПЦК — на уровне основания передних щипцов мозолистого тела. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля, выявляли глиальный фибриллярный кислый белок астроцитов (GFAP — с использованием мышиных антител, клон GA-5, Biocare medical, США, разведение 1:250) и Iba1антиген мембран клеток амебоидной формы глиоцитов (при помощи козьих поликлональных антител к Iba1, AbCam, Великобритания, разведение 1:200). Вторичные биотинилированные антитела применяли из набора VECTASTAIN ABC (США). После проявления связанных антигенов диаминобензидином (DAB) срезы докрашивали гематоксилином Карацци. Визуальную и морфометрическую оценку клеточных элементов исследованных структур мозга осуществляли в трех последовательных квадратах площадью 0,01 мм2 у каждого животного в группе (n=12). На срезах, окрашенных по Нисслю, подсчитывали тела астроцитов, олигодендроцитов, микроглиоцитов, эндотелиоцитов, а также нейронов после их идентификации согласно классификации Ю. М. Жаботинского [7], широко используемой в современных нейроморфологических исследованиях [5, 6, 8], как неизмененные (малоизмененные), гипохромные, сморщенные гиперхромные (пикноморфные) и теневидные. Определяли абсолютное количество и долю данных форм, площадь тел жизнеспособных нейронов (малоизмененных и гипохромных), расстояние между их телами, а также телами астроцитов и стенкой кровеносного капилляра в пределах окружности радиусом 20 мкм. Астроциты идентифицировали по светлым ядрам овальной и округлой формы, диаметр которых находился в пределах 5–8 мкм и имеющим на срезе отчетливо видимое ядрышко. Ядра были окружены светлым ободком цитоплазмы толщиной 1–4 мкм. Подсчитывали количество олигодендроцитов, определяли глиоцито-нейрональный индекс (как отношение количества клеток-сателлитов к количеству малоизмененных и гипохромных нейронов), количество эндотелиоцитов и площадь их ядер. Олигодендроциты были идентифицированы по гиперхромным ядерам округлой формы, диаметр которых составлял 3–5 мкм, снаружи которых часто был различим узкий светлый ободок цитоплазмы толщиной не более 2 мкм. Эндотелиоциты идентифицировали по самым небольшим гиперхромным ядрам вытянутой формы, обращенным в просвет капилляра, часто содержащего эритроциты. На срезах при реакции на GFAP определяли количество астроцитов, расстояние от их тел до стенки капилляра в пределах окружности радиусом 20 мкм (контроль результата, полученного аналогичным способом на срезах, окрашенных по Нисслю), площадь тел астроцитов и длину их осевых отростков. При реакции Iba1 определяли количество и площадь микроглиоцитов. Морфометрию проводили с помощью программы Imagescope. Среднее арифметическое, среднее квадратическое отклонение и стандартную ошибку среднего определяли с помощью компьютерной программы Excel. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при Р<0,05. Результаты исследования. Тела большинства нейронов ПНЯ и исследованных слоев цингулярной коры у интактных крыс были неизмененными, т. е. содержали хроматофильную субстанцию, имели четкие ровные контуры клеточной и ядерной поверхности. Единичные нейроны выглядели гипохромными, пикноморфными и теневидными. Все нейроны находились на разном расстоянии от стенки кровеносных капилляров, клетки сателлитной глии были единичными (рис. 1, а; 2, а; табл. 1). Ядра астроцитов, чаще занимающие центральное положение в теле клетки, были окружены равномерно экспрессируемыми белками промежуточных филаментов (см. рис. 1, б; 2, б). Тонкие осевые отростки астроцитов ПНЯ в количестве от 1 до 5 и глубоких слоев ПЦП в количестве от 2 до 7 также равномерно экспрессировали GFAP. Концевые части некоторых отростков образовывали тонкие периваскулярные глиальные мембраны, экспрессия GFAP которых в отдельных небольших участках была прерывистой. Средняя длина осевых отростков астроцитов на плоскости в 3–4 раза превышала длинный диаметр тел клеток, которые по отношению к капиллярам были расположены на разном расстоянии (табл. 2). Микроглиоциты были самыми малочисленными клетками (см. рис. 1, а; 2, а; табл. 3), они располагались преимущественно по ходу капилляров и экспрессировали Iba1 в удлиненном клеточном теле и основании осевых отростков (см. рис. 2, в). Эндотелиоциты встречались в 2–3 раза чаще, чем микроглиоциты, но несколько реже макроглиоцитов и имели самые мелкие ядра из всех клеточных элементов. В ПНЯ и ПЦП у ЛОЖ через 7 сут значимых изменений морфометрических параметров всех клеточных элементов не наблюдалось. После 7 сут гипоксии среди нейронов ПНЯ преобладали набухшие гипохромные, а в ПЦП — теневидные и гиперхромные пикноморфные формы (см. рис. 1, в; 2, г). Наименее измененные единичные нейроны, определявшиеся вблизи кровеносных капилляров, были окружены сателлитной формой олигодендроцитов и астроцитов. Тела этих нейронов были набухшими, но сохранившими скопления глыбок хроматофильного вещества. Малоизмененные нейроны в ПЦП встречались значительно реже, чем в ПНЯ (0,3±0,3 и 2,8±1,7% соответственно, Р<0,05; см. табл. 1). Набухшие гипохромные нейроны в ПНЯ встречались в 3,3 раза чаще, чем в ПЦП. Гиперхромные сморщенные и теневидные нейроны чаще были обнаружены в ПЦП, чем в ПНЯ (в 4,8 и 1,2 раза соответственно, Р<0,05). В отличие от ПНЯ, ПЦП было лишено жизнеспособных нейронов (малоизмененных, гипохромных и пикноморфных) почти наполовину, которые, как и бóльшая часть теневидных клеток, группировались вблизи капилляров. Между перикапиллярными скоплениями нейронов были видны участки разреженности клеток, среди которых располагались единичные измененные нейроны. В ПНЯ таких участков разреженности нейронов не было. Расстояние между телами жизнеспособных нейронов и стенкой капилляров в обеих исследованных формациях мозга после пролонгированной гипоксии значительно сократилось по сравнению с таковым в контрольных группах. Степень набухания нейронов и сокращение расстояния их тел до стенки капилляров, а также глиоцито-нейрональный индекс в ПЦП по сравнению с данными параметрами в ПНЯ при пролонгированной гипоксии были незначительно больше (0,05<Р<0,1) и существенно различались с параметрами обеих контрольных групп. В астроцитах сравниваемых формаций мозга в результате пролонгированной гипоксии были выявлены значительные различия реактивных изменений (см. рис. 1, г; 2, д). В ПНЯ значительное увеличение площади их тел (см. табл. 2) было обусловлено гипертрофией цитоплазмы, равномерно и интенсивно экспрессирующей GFAP, окружающей неизмененное ядро, у некоторых клеток расположенное слегка эксцентрично. Отростки были утолщены и укорочены (в 1,6 раза; Р<0,05). Периваскулярные глиальные мембраны выглядели утолщенными и непрерывными. Они так же, как тела и отростки астроцитов, равномерно экспрессировали GFAP. Большинство тел находились в непосредственной близости от стенки капилляров; расстояние между ними, установленное как при окраске по Нисслю, так при реакции на GFAP, было меньше в 3,6–7,3 раза (Р<0,05), чем в контрольных группах. Астроциты ПЦП отличались отеком цитоплазмы и ядра, а также разреженностью, фрагментацией и смещением GFAP-позитивного материала к одной из сторон клеточного тела. Длина осевых отростков клеток не отличалась от этого параметра в обеих контрольных группах. Уровень экспрессии GFAP в отростках астроцитов и периваскулярных глиальных мембранах был снижен, GFAP-позитивный материал на большем протяжении мембран был неразличим. Расстояние между телами астроцитов и стенкой капилляра по сравнению с контролем сократилось (в 4,1–14,6 раза). Степень уменьшения этого расстояния в ПЦП была незначительно больше, чем в ПНЯ (0,05<Р<0,1). Количество астроцитов и олигодендроцитов в ПНЯ и ПЦП осталось без изменений. Количество микроглиоцитов в обеих структурах было несколько увеличено (см. табл. 3); также была увеличена и площадь их тел (в 1,3–1,5 раза; Р<0,05). Многие клетки в ПНЯ остались вблизи сосудов и приобрели округлую форму, большая часть активированных микроглиоцитов в ПЦП группировались вблизи измененных нейронов и имели вытянутую форму. Количество эндотелиоцитов было значительно увеличено только в ПЦП (см. рис. 1, в; 2, г; табл. 3), хотя на отдельных срезах ПНЯ они располагались небольшими группами и в обеих формациях имели значимо большую площадь ядер (Р<0,05), чем в контроле. Обсуждение полученных данных. Несмотря на то, что в настоящем исследовании была использована модель фокальной гипоксии переднего мозга, выключающая его основные функции [12], полученные нами данные свидетельствуют о значительном спектре структурнофункциональных нарушений клеточных элементов ПНЯ, получающих кровь из действующего капиллярного русла срединных среднемозговых артерий. Изменения нейронов в виде острого набухания, лизиса и образование клеток-теней в ПНЯ через 7 сут опыта не могут не быть отсроченным проявлением глутамат-кальциевого каскада как результата взаимодействия системы «нейрон—астроцит—капилляр—нейрон». В ходе гуморального варианта этой реакции, распространяющейся вширь от зоны пенумбры, в нейронах происходят активация кальмодулин-зависимых клеточных ферментов, оксидантный стресс, избыточная выработка токсичного оксида азота и накопление низкомолекулярных цитотоксичных соединений [3]. Нейроны в ПЦП, переживающие, кроме реакций глутамат-кальциевого каскада, состояние гипоксии, погибают, реже сморщиваются, по-видимому, вследствие конденсации органелл [2] либо набухают. Концентрация тел жизнеспособных нейронов и астроцитарных глиоцитов вблизи кровеносных капилляров может быть обусловлена как появлением участков «выпадения» клеток при распаде апоптотических телец [11], так и благодаря их перемещению в пространстве. Способность к миграции жизнеспособных нейронов: гипохромных, пикноморфных, единичных малоизмененных, как и астроцитов, в направлении стенки капилляров связана с содержанием густой сети микрофиламентов, распределенных вблизи плазмолеммы тел и отростков этих клеток [2, 16]. Можно полагать, что астроциты и связанные с ними тела нейронов в ПНЯ приблизились к стенке капилляров в начале ишемического воздействия, поскольку через 7 сут многие из астроцитов уже представляли собой периваскулярную форму клеток, отростки которых были укорочены, окружали стенку капилляров, обладали признаками гипертрофии и увеличенной экспрессией GFAP. Также логично предположить, что в результате миграции астроциты и связанные с ними нейроны ПЦП, находящиеся в фокусе гипоксии, приобрели периваскулярную локализацию в более ранние сроки опыта, поскольку астроциты к его концу обладали отчетливо выраженными признаками дистрофии. Выявленные признаки гипертрофической реакции астроцитов, не долго переживающих гипоксию на значительном удалении от ее фокуса, коррелируют с данными о накоплении гликогена и увеличении продукции промежуточных филаментов в этих клетках в зоне пенумбры [13]. Значительное увеличение числа клетоксателлитов в условиях жесткой гипоксии следует расценивать как чувствительную компенсаторную неспецифическую глиальную реакцию, выявленную также при алкогольной и опиатной абстиненции [1, 2] и наркотической гипоксии [1]. Девятикратное увеличение глиоцитонейронального индекса может свидетельствовать о напряженной передаче глиальных нутриентов перикарионам нейронов. Таким образом, клеточные элементы головного мозга при переживании разных условий циркуляторной гипоксии характеризуются спектром выраженных патологических изменений. Нейроны находятся в процессе сморщивания— гиперхромии, лизиса и превращения в «клеткитени». Клетки ядерной зоны гипоксии склонны к гибели или сморщиванию—гиперхромии. Нейроны, расположенные за пределами области гипоксии (например ПНЯ) и испытывающие лишь гуморальное воздействие реакций глутаматкальциевого каскада, склонны к острому набуханию. Реакция микроглиоцитов в виде слабо выраженного увеличения их числа и признаков активации является ранним диффузным проявлением переднемозговой фокальной гипоксии. Пролиферация эндотелиоцитов через 7 сут ишемического воздействия не связана с цепью каскадных реакций и наблюдается лишь в фокусе гипоксии, т. е. в ПЦП. Концентрация жизнеспособных нейронов и астроцитов вблизи кровеносных капилляров, а также рост числа сателлитных форм глии являются адаптационными механизмами и условием выживания клеток при различных ишемических воздействиях на головной мозг.

About the authors

A. V. Droblenkov

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: droblenkov_a@mail.ru

N. V. Naumov

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: b15@zdrav.spb.ru

M. V. Monid

RAMS Institute of Experimental Medicine

E. I. Valkovich

St. Petersburg State Pediatric Medical University

P. D. Shabanov

RAMS Institute of Experimental Medicine

References

Supplementary files