DECALCIFICATION IN FORMIC ACID AFTER FIXATION IN ZINC-ETHANOLFORMALDEHYDE DOES NOT PRECLUDE IDENTIFICATION OF NEURONAL AND GLIAL MARKERS

Full Text

В настоящее время иммуногистохимическое выявление различных нейрональных и глиальных белков широко используется для изучения спинного мозга и чувствительных узлов спинномозговых нервов (ЧУСН). Описанный в литературе метод извлечения спинного мозга с оболочками, корешками и ЧУСН из позвоночного канала довольно трудоемкий и требует большой квалификации оперирующего [3]. Однако даже при использовании этого малотравматичного способа не в полной мере сохраняются все анатомические соотношения структур. Для некоторых исследований предпочтительным является изготовление срезов органокомплекса, состоящего из спинного мозга, окруженного позвонками и прилежащими мышцами. Приготовление парафиновых срезов объектов, которые содержат костные фрагменты, и их дальнейшее иммуногистохимическое исследование требуют предварительного декальцинирования образцов. Обычно с этой целью применяют разбавленные сильные кислоты (азотную или соляную) [4], хелатирующие агенты (этилендиаминтетрауксусную кислоту) [5, 7, 10] или слабые кислоты (муравьиную, уксусную или пикриновую) [4]. Однако ряд исследований показывают, что применение данных реагентов может вызвать денатурацию белков, что проявляется снижением активности ферментов и уменьшением чувствительности иммуногистохимических реакций [5, 6, 8]. J. A. Ramos-Vara и M. A. Miller [9] показали, что различные антигены не одинаково реагируют на кислотное декальцинирование и длительность воздействия декальцинирующих агентов. Цель настоящей работы состояла в определении возможности иммуногистохимического выявления различных тканевых антигенов на парафиновых срезах спинного мозга крысы, фиксированного в цинк-этанол-формальдегиде после проведения декальцинации муравьиной кислотой. Содержание и умерщвление животных осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Исследовали шейный отдел спинного мозга, окруженного костной тканью позвоночника и прилежащими мышцами у взрослых крыс (n=5) и новорожденных крысят (n=2) линии Вистар. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [2] в течение 1 сут и декальцинировали в растворе следующего состава: вода дистиллированная — 150 мл; раствор муравьиной кислоты 85% (Вектон, Россия) — 50 мл; формеат натрия (Ч, Вектон, Россия) — 7 г. Материал от взрослых крыс декальцинировали в растворе муравьиной кислоты в течение 3 сут при комнатной температуре, материал от новорожденных крысят — в течение 1 сут при комнатной температуре и перемешивании. Степень завершенности процесса декальцинации контролировали с помощью препаровальной иглы. После завершения декальцинирования материал промывали в дистиллированной воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, удаляли этанол петролейным эфиром и заливали в парафин. Серийные срезы толщиной 5 мкм подготавливали к иммуногистохимическим исследованиям по общепринятой методике с использованием теплового демаскирования антигенов [1]. Для проверки сохранности антигенов в исследуемом материале были проведены иммуногистохимические реакции с применением антител к разным группам антигенов (ядерных, цитоплазматических). В настоящем исследовании использовали реакции на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), нейрофиламенты (NF), ядерный белок нервных клеток (NeuN), тирозингидроксилазу (ТН), белок синаптических пузырьков — синаптофизин (SYP) и белок промежуточных филаментов — виментин (Vim). При постановке реакций использовали различные первичные и вторичные антитела (таблица). Иммуногистохимическое выявление антигенов проводили в соответствии с ранее опубликованными протоколами [1]. Для контроля иммуногистохимической реакции использовали препараты ЧУСН взрослых крыс (n=3), а также препараты спинного мозга новорожденных крысят, не подвергшиеся декальцинации (n=3). При постановке иммуногистохимических реакций были получены хорошие результаты выявления всех специфических антигенов со всеми используемыми антителами. Распределение окрашенного продукта реакции в каждом исследуемом случае соответствовало общим представлениям о локализации структур, которые должны его содержать (внутренний положительный контроль). Как известно, GFAP образует глиальные промежуточные филаменты как в зрелых, таки в дифференцирующихся астроцитах [1]. В спинном мозгу новорожденных крысят и у взрослых крыс положительную реакцию на GFAP давали астроциты, локализованные в белом и сером веществе (рисунок, а). При выявлении NF наблюдалось окрашивание толстых нервных волокон в белом веществе и сети тонких переплетенных волокон в сером веществе спинного мозга (см. рисунок, б). Также в мышечной ткани вблизи спинного мозга наблюдалось окрашивание небольших нервных пучков и нервных стволов с толстыми осевыми цилиндрами. ТН является маркером катехоламинергических нейронов [1]. В настоящем исследовании в белом веществе спинного мозга было выявлено небольшое количество ТН-иммунопозитивных тонких осевых цилиндров. В сером веществе наблюдалось окрашивание нервных волокон, локализованных преимущественно в задних рогах спинного мозга. В прилегающих к спинному мозгу мышцах положительная реакция на ТН была обнаружена в нервных волокнах вокруг поперечных срезов мелких сосудов. Положительную реакцию на NeuN давали многие нейроны, локализованные в сером веществе спинного мозга, а также ярко окрашивались ядра большинства нейронов ЧУСН (см. рисунок, в). Реакция на SYP позволила выявить в сером веществе вокруг нейронов и их отростков большое количество синаптических бутонов различного размера (см. рисунок, г). Иммунопозитивная реакция на SYP обнаружена в цитоплазме некоторых крупных и мелких нейронов ЧУСН. За пределами спинного мозга хорошо выявились SYP-позитивные терминали вблизи сосудов скелетных мышц. Положительную реакцию на Vim давали эпендима центрального канала, эндотелий кровеносных сосудов, а также глиальные элементы ЧУСН. Интенсивность реакций была сопоставима с интенсивностью реакции на срезах материала, не подвергшегося декальцинации. Полученные данные позволяют сделать вывод, что фиксация в цинк-этанол-формальдегиде позволяет стабилизировать нейрональные и глиальные антигены и сохранять их при дальнейшей декальцинации в растворе муравьиной кислоты для проведения иммуногистохимического исследования.

About the authors

E. A. Kolos

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

D. E. Korzhevskiy

RAMS North-Western Branch Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru

References

Supplementary files