HISTOMORPHOMETRIC CHARACTHERISTIC OF SKELETAL MUSCLE REGENERATING AFTER A CLOSED PARTIAL CRUSH INJURY

Full Text

Травмы скелетных мышц (контузия, раздавливание, разрыв, отморожение) вызывают длительные, иногда необратимые нарушения опорнодвигательных функций [12]. Их сочетание с переломами костей приводит к замедлению и снижению прочности костного сращения [11]. Между тем, существующие консервативные и оперативные методы лечения повреждений мышц недостаточно эффективны. Гистогенетические основы регенерационного миогенеза хорошо изучены [2, 7]. Независимо от механизма повреждения мышечные волокна подвергаются дегенерации, в которой участвуют клетки воспалительного ряда. Регенераторные потенции мышц определяются присутствием тканеспецифичных клеток-предшественников (миосателлитоцитов) в неповреждённых участках базальных мембран, а также возможностями реваскуляризации и реиннервации. Дифференцировка миосателлитоцитов в миобласты, пролиферация и слияние последних приводят к формированию многоядерных миотуб и мышечных волокон de novo. Многие миобласты сливаются с частично некротизированными мышечными волокнами и предотвращают их полную дегенерацию. С помощью иммунофлюоресцентных методов установлено, что после полного раздавливания медленных мышц «миолиз» [6] сопровождается разрушением базальных мембран и фиброзом; в быстрых мышцах базальные мембраны сохраняются, перестраиваются в процессе регенерации, и мышца приобретает, по выражению авторов, квази-нормальную структуру уже через 16 сут. Для количественной оценки регенерации мышц применяются маркеры пролиферации, дифференцировки и становления метаболических типов мышечных волокон [8, 10]; гистоморфометрические параметры используются ограниченно. Несмотря на многочисленные исследования различных моделей повреждения мышц [1, 2, 6-10, 13], вопрос о полноте спонтанной регенерации после закрытого частичного раздавливания не имеет определённого ответа, хотя именно такой вид травмы наиболее часто встречается в клинике. Цель настоящего исследования - гистоморфометрическая оценка восстановления скелетной мышцы на стандартизованной экспериментальной биологической модели закрытого частичного раздавливания. Материал и методы. Исследование проведено на 18 взрослых белых крысах-самцах линии Вистар, которые содержались в условиях вивария. При выполнении экспериментов руководствовались требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и принципами Европейской конвенции [3]. У 15 животных под комбинированным наркозом в условиях операционной изогнутым эластичным кишечным зажимом в течение 20 с проводили сдавление голени на уровне средней трети при стандартном положении клемм, вызывающее формирование компрессионной борозды. Животных выводили из опыта через 7, 21 и 90 сут после операции. Для морфологических исследований иссекали среднюю треть передней большеберцовой мышцы (область компрессионной борозды). После альдегидно-осмиевой фиксации образцы измельчали по стандартной схеме, заливали в аралдит. Поперечные и продольные полутонкие (толщиной 1 мкм) срезы получали на ультратомах PM III (LKB, Швеция) и окрашивали по Б. Уикли [5] и M. Ontell [14]. Препараты изучали, используя микроскопы Opton (ФРГ), и проводили количественный анализ. Используя аппаратно-программный комплекс при инструментальном увеличении 800, получали цифровые изображения. Их геометрическую калибровку проводили с помощью цифрового изображения шкалы объектмикрометра. Пользуясь электронной версией оригинальной тестовой решетки [4], в графическом редакторе PhotoFiltre осуществляли точечную объемометрию. Определяли объемную долю (плотность, %) мышечных волокон (VVmf), микрососудов (VVmv), эндомизия (VVend) и нейральных элементов во внутримышечных нервах (VVneur). В каждом поле зрения определяли число мышечных волокон и микрососудов, рассчитывали их численную плотность как среднее число в поле зрения (NAmf соответственно), индекс васкуляризации и NAmv ), численную плотность внутримышечных ядер (NAmv/NAmf), индекс нуклеации (NAinuc/ NAmf). Результаты стереологического анализа мышц у экспериментальных животных сопоставляли с данными, полученными в аналогичных исследованиях мышц 3 интактных крыс. По результатам измерений минимального диаметра каждого мышечного волокна в выборке из 300 волокон от каждого животного оценивали распределение мышечных волокон по диаметру. Результаты исследования. Через 7 сут после операции передняя большеберцовая мышца в области компрессионной борозды имела неоднородную структуру. В поверхностной и глубокой (прилежащей к большеберцовой кости) зонах обнаруживались как деструктивно-измененные, так и регенерирующие волокна (рис. 1, а, б), ав центральной зоне преобладали дистрофически измененные мышечные волокна (см. рис. 1, в). В зонах деструкции были выражены признаки некроза и замещения передавленных участков мышечных волокон грануляционной тканью. Изредка обнаруживались врастающие в неё «мышечные почки», но диастазы между концами передавленных волокон не перекрывались. В поперечных срезах зона деструкции отличалась малыми диаметрами мышечных волокон, их округлёнными или деформированными контурами, отчетливо выраженным отёком, гиперваскуляризацией и повышенным количеством клеток в эндомизии. В нём, кроме фибробластов и макрофагов, встречались миобласты, а также перицитоподобные клетки, которые располагались вблизи сосудов микроциркуляторного русла клетки и имели характерную перстневидную форму, но покинули типичные для сформированных капилляров позиции. В мышечных волокнах увеличено количество ядер: по периферии саркоплазмы, в позиции миосателлитоцитов, а также внутри саркоплазмы; многие из них располагались тесными парами или группами. В некоторых регенерирующих мышечных волокнах выражен грубый миофибриллярный рисунок и даже восстановление поперечной исчерченности. В зонах с преобладанием дистрофических изменений наблюдалось округление или спадение контуров мышечных волокон, вакуолизация саркоплазмы, расширение прослоек эндомизия с увеличением содержания фибробластов и коллагеновых волокон. К 21-м суткам после операции происходило замещение грануляционной ткани регенерирующими мышечными волокнами; многие из них имели булавовидные вздутия, были гофрированы и деформированы (см. рис. 1, г). По-прежнему встречались мышечные волокна с эктопическими ядрами, которые имели округлую форму, светлую нуклеоплазму и хорошо выраженные увеличенные ядрышки. Аналогичными признаками обладали и многие периферически расположенные ядра. Нередки были мышечные волокна с усиленной базофилией саркоплазмы и грубым рисунком миофибрилл, а также расщеплённые волокна (см. рис. 1, д, е). Через 90 сут после операции зона повреждения определялась микроскопически по дезориентации мышечных волокон либо незначительным участкам замещения мышечных элементов соединительной тканью. Мышечные волокна отличались более плотным расположением, чем в предыдущий срок (см. рис. 1, ж), но в некоторых участках мышцы преобладали мелкие волокна с нарушенной (косопродольной) ориентацией (см. рис. 1, з) и дистрофически изменённые «дольчатые» волокна (см. рис. 1, з, и). Стереологический анализ был проведён через 21 и 90 сут после операции. Через 21 сут объемная доля мышечных волокон в регенерирующей мышце, по сравнению с таковой в интактной, снижена на 27,8%, микрососудов - увеличена в 2,3 раза, эндомизия - в 6,3 раза, а коллагеновых волокон - в 15,6 раза (табл. 1). Объемная доля нейральных элементов во внутримышечных нервах не превышает 30%, что связано с валлеровской дегенерацией, эндоневральным отёком и аксональной атрофией в части нервных волокон. По сравнению с интактной мышцей численная плотность мышечных волокон была увеличена в 3,2 раза, микрососудов - в 1,3 и внутримышечных ядер - в 4,9 раза (табл. 2). Индекс васкуляризации был уменьшен на 58,6%, а индекс нуклеации увеличен на 33,3%. Через 90 сут после операции по сравнению с предыдущим сроком опыта уменьшались объёмная доля эндоневрия (в 3,8 раза) и содержание коллагеновых волокон (на 57,7%). При этом увеличивались объемная доля (на 21,7% ) и численная плотность микрососудов (на 31,6%), значительно (на 39,6%) возрастал и индекс васкуляризации мышцы, однако, по сравнению с интактной мышцей этот параметр был снижен на 42%. Несмотря на значимое увеличение объемной доли нейральных элементов по сравнению с таковой в предыдущем сроке, показатель не достигал уровня в интактной мышце. Не имел значимых отличий от значения в интактной мышце индекс нуклеации, что свидетельствует о затухании регенерационного процесса. При анализе распределения мышечных волокон по диаметру (рис. 2) установлено, что через 21 сут после операции гистограмма была резко смещена влево по сравнению с гистограммой интактной мышцы, её главный пик располагался в диапазоне 0,1-10 мкм. Через 90 сут после операции вариативность диаметров мышечных волокон была сопоставима с таковой в интактной мышце, но распределение имело бимодальный характер. Обсуждение полученных данных. Для разработки методов лечения травм скелетных мышц необходимы клинически адекватные биологические модели повреждений. С этой точки зрения модель закрытого частичного раздавливания представляет практический интерес. В качестве объекта исследования выбрана передняя большеберцовая мышца крыс, имеющая преимущественно продольную ориентацию мышечных волокон, что облегчает задачи стереологического анализа. Применение хирургического инструмента с шириной бранш, равной 1/3 длинника передней большеберцовой мышцы крысы, позволило стандартизовать степень и локализацию зоны повреждения. Как показали результаты выполненного исследования, повреждение вызывало полный либо частичный некроз мышечных волокон, а также их дистрофические изменения на фоне редуцированного кровоснабжения и частичной денервации. По данным выполненного количественного исследования, в мышце, регенерирующей после закрытого частичного раздавливания, даже при спонтанном заживлении происходит значительное увеличение объёмной доли мышечных волокон (до 92,5% от соответствующего параметра интактной мышцы), а также существенное уменьшение долей эндомизия и коллагеновых волокон. Судя по изменениям характера распределения по диаметру, большинство мышечных волокон укрупняются, но даже через 90 сут после повреждения в регенерирующей мышце увеличено представительство волокон малого диаметра (20 мкм и менее) в результате стойкой атрофии части волокон, а также гиперпластического регенераторного ответа, включающего расщепление и новообразование мионов, многие из которых приобретали не свойственную нормальной мышце ориентацию. Известно, что эти мелкие волокна на ультраструктурном уровне характеризуются хаотичным расположением миофибрилл и субсарколеммальными скоплениями митохондрий [15]. Кроме того, в конце опыта обнаружены скопления дистрофически изменённых («дольчатых») мышечных волокон, связанных с нарушениями оксидативного метаболизма и сократительной функции при денервации [15]. Известно, что разработка методов лечения разрывов мышц сфокусирована на стимуляции миогенеза и редуцировании фиброза [13]. Полученные нами результаты свидетельствуют, что при закрытом частичном раздавливании для морфофунционального восстановления мышцы более критичен фактор неполной реиннервации, что должно быть учтено при разработке адекватных терапевтических воздействий. Выводы. Итак, регенерат передней большеберцовой мышцы крыс в зоне компрессионной борозды после закрытого частичного раздавливания характеризуется преобладанием мышечных элементов, восстановлением вариативности диаметров мышечных волокон, существенным уменьшением фиброза и увеличением васкуляризации эндомизия, однако вплоть до 90 сут после повреждения сохраняется разветвлённая структура и миопатические изменения регенерирующих мышечных волокон в результате незавершённого реиннервационного процесса.

About the authors

N. A Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Clinical-and-Experimental Laboratory of Reconstructive-and-Restorative Microsurgery and Surgery of the Hand

M. M. Shchudlo

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Email: m.m.sch@mail.ru
Clinical-and-Experimental Laboratory of Reconstructive-and-Restorative Microsurgery and Surgery of the Hand

N. A. Kononovich

G. A. Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopedics

Clinical-and-Experimental Laboratory of Reconstructive-and-Restorative Microsurgery and Surgery of the Hand

References

Supplementary files