CHANGES IN THE EXPRESSION OF BCL-2 ANTIAPOPTOTIC PROTEIN IN RAT NEOCORTEX AND HIPPOCAMPUS UNDER THE INFLUENCE OF VARIOUS MODES OF HYPOBARIC HYPOXIA

Full Text

В 80-е годы прошлого столетия была обнаружена отсроченная гибель нейронов в поле СА1 гиппокампа спустя несколько суток после ишемии [7]. Впоследствии тоже было выявлено и в других наиболее чувствительных к гипоксии/ ишемии областях мозга - неокортексе, стриатуме, мозжечке. Установлено, что подобного вида повреждения нейронов связаны с механизмом индукции апоптоза (запрограммированной клеточной смерти) с вовлечением генов и белковкиллеров [8]. Центральное место в регуляции механизмов апоптоза занимают белки семейства генов bcl-2 - проапоптотические Bax, Bcl-xs и антиапоптотические - Bcl-2, Bcl-xL [6, 9, 10]. Индукция апоптоза вслед за повреждающими воздействиями ишемии/гипоксии в уязвимых областях мозга связана с увеличением содержания проапототических и снижением - антиапоптотических белков. В начале 90-х годов прошлого столетия был обнаружен другой феномен «ишемической/гипоксической толерантности мозга», индуцируемой перед повреждающим воздействием умеренной, так называемой прекондиционирующей (ПК) ишемией/гипоксией, в значительной степени предотвращающей гибель нейронов в уязвимых областях мозга [1]. Было показано, что ПК умеренной гипобарической гипоксией (УГГ) способно нивелировать структурно-функциональные повреждения нейронов гиппокампа и неокортекса, а также изменять соотношения в них содержания про-и антиапоптотических белков, индуцируемых тяжелой гипоксией (ТГ) [14, 15]. Известно, что различные режимы (по кратности, длительности) ПК-воздействий оказывают неоднозначное по эффективности влияние на внутриклеточные механизмы протекции. Необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на выявление оптимальных режимов ПК, вызывающих наиболее эффективную мобилизацию защитных механизмов, в частности, участвующих в регуляции процесса апоптоза [1]. Цель настоящего исследования - изучение влияния нескольких режимов ПК с использованием УГГ на экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 в нейронах неокортекса и гиппокампа до и после повреждающей ТГ. Материал и методы. Работа выполнена на 72 взрослых самцах крыс линии Вистар массой 200-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. ТГ создавали в барокамере проточного типа при атмосферном давлении 180 мм рт. ст. в течение 3 ч. В режиме ПК крыс подвергали УГГ (давление в барокамере составляло 360 мм рт. ст.) в течение 2 ч. Эти 2 режима использовали в различных комбинациях в следующих экспериментальных группах (по 6 животных в каждой группе): 1-я группа - крысы, подвергнутые действию ТГ; 2-, 3-, 4-я группы - крысы, подвергнутые 1, 3 или 6 сеансам гипоксического ПК (в случае 3-и 6-кратного ПК интервал между сеансами был 24 ч) и спустя 24 ч - ТГ; 5-, 6-, 7-я группы - крысы, подвергнутые только 1, 3 или 6 сеансам гипоксического ПК; 8-я группа - контрольная группа животных, которых помещали в барокамеру при нормальном атмосферном давлении на 3 ч. Через 3 и 24 ч после ТГ или через 24 ч после последнего сеанса ПК крыс декапитировали и извлекали головной мозг, который фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4), в течение 24 ч и подвергали гистологической обработке по стандартному протоколу. Изготавливали серии чередующихся парафиновых фронтальных срезов мозга толщиной 7 мкм на уровне -2,8 мм от брегмы и монтировали их на предметные стекла. Для оценки экспрессии Bcl-2 в неокортексе и гиппокампе крыс использовали иммуноцитохимический метод с компьютерным анализом микроизображений. Для этого после стандартных процедур депарафинирования, регидратации и демаскировки антигена срезы в течение ночи при 4 ºC инкубировали с первичными поликлональными антителами к Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, США, разведение 1:100) и далее использовали авидин-биотиновую систему детекции (Vector Labs, США). Для визуализации реакции использовали диаминобензидин. После обезвоживания и заключения срезов в желатин проводили количественный анализ иммунореактивности нейронов с использованием системы, состоящей из светового микроскопа Olympus CX31 (Olympus, Япония), цифровой камеры Progres CT1 (Jenoptic, Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением Videotest Master Morphology 5.2. Определяли величину оптической плотности каждой клетки в условных единицах (усл. ед.) яркости. Иммунопозитивными (ИП) считались клетки, оптическая плотность которых превышала показатель фона на 2 усл. ед. На основании заданных параметров, исходя из показателей оптической плотности, все ИП-клетки разделяли на 2 класса: интенсивно и слабо ИП. К первому классу относили нейроны с условным показателем в пределах 0,13-1,00, ко второму - в интервале 0,02-0,13. Анализировали общее число ИП-клеток и их распределение по классам интенсивности. Результаты статистически обрабатывали с помощью пакетов анализа данных STATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel’2003, использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA (Р<0,05). Все данные представлены в виде среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. Результаты выражены в процентах от контроля, который был принят за 100. Результаты исследования. В различных сериях экспериментов оценивали особенности влияния УГГ и ТГ, а также их сочетанного воздействия на характер экспрессии Bcl-2 в нейронах неокортекса и вентрального отдела гиппокампа (поля СА3/СА4). В неокортексе в контрольной группе животных был отмечен низкий уровень Bcl-2иммунореактивности, причем преобладали клетки, относящиеся к слабо ИП-нейронам. ТГ приводила к подавлению экспрессии Bcl-2 в неокортексе. Это проявлялось снижением общего числа Bcl-2-ИП-клеток на 30 и 20% по сравнению с контролем к 3 и 24 ч после воздействия и отсутствием интенсивно ИП-клеток (рис. 1, а, б). 1-кратное ПК не изменяло общего количества Bcl-2-ИП-клеток, но приводило к снижению интенсивности иммунореактивности на 60-70% к 3 и 24 ч после ТГ (см. рис. 1, а, в). Многократные воздействия УГГ существенно повышали экспрессию Bcl-2 в неокортексе в ответ на ТГ. При этом, происходило увеличение как общего числа Bcl-2-ИП-клеток, так и интенсивно ИП-нейронов. При применении 3-кратного воздействия УГГ наблюдалось умеренное увеличение (на 30% по отношению к контролю) общего количества Bcl2-ИП-клеток (см. рис. 1, а) к 24 ч после ТГ, а интенсивность экспрессии составляла 800 и 1000% к 3 и 24 ч соответственно (см. рис. 1, г). В случае 6-кратно ПК ТГ максимальная экспрессия наблюдалась через 3 ч: общее число ИП-клеток увеличивалось на 77%, а количество интенсивноэкспрессирующих - на 1300% по отношению к контролю. К 24 ч общее количество ИП-нейронов снижалось до 150%, а интенсивно ИП-клеток - до 730% относительно контроля (см. рис. 1, а, д). В нейронах полей СА3/СА4 гиппокампа в контрольной группе животных наблюдался низкий уровень Bcl-2-иммунореактивности. При этом, уровень экспрессии Bcl-2 в гиппокампе был гораздо ниже, чем в неокортексе. ТГ и ТГ с 1-кратным ПК не влияли на уровень экспрессии Bcl-2 в нейронах полей СА3/СА4 гиппокампа через 3 и 24 ч после воздействия (см. рис. 1, е-з). В отличие от этого, при многократных сеансах ПК происходило существенное увеличение экспрессии Bcl-2 после ТГ, в основном за счет увеличения доли интенсивно ИП-клеток. Интенсивность экспрессии составляла 2550 и 4760% по отношению к контролю через 3 ч после ТГ в случае 3-и 6-кратного ПК соответственно. Через 24 ч отмечалось незначительное снижение доли интенсивно ИП-клеток до 1650 и 3225% по отношению к контролю в случае 3-и 6-кратного ПК соответственно (см. рис. 1, е, и, к). В трех сериях экспериментов (группы 5-7) оценивали характер экспрессии Bcl-2 в ответ на воздействие УГГ в режиме ПК, без последующей ТГ. 1-кратный сеанс УГГ приводил к незначимому увеличению общего количества Bcl-2-ИП-клеток в неокортексе (на 65% по отношению к контролю) (рис. 2, а), но, вместе с тем, вызывал снижение интенсивности иммунореактивности (на 70%) (см. рис. 2, б, г). В гиппокампе в ответ на 1-кратный сеанс УГГ уровень экспрессии Bcl-2 не изменялся (рис. 3, а, б, г). В отличие от этого, многократные сеансы УГГ существенно повышали уровень Bcl-2 в обеих исследуемых областях. В неокортексе 3-и 6-кратные воздействия УГГ приводили к увеличению как общего количества Bcl-2-ИП-клеток (на 250%), так и интенсивно ИП-клеток (на 513 и 793% по отношению к контролю для 3-и 6-кратных воздействий УГГ соответственно) (см. рис. 2, а, б, д, е). В полях СА3/СА4 гиппокампа общее количество Bcl-2-ИП-клеток увеличивалось на 880 и 1100%, а доля интенсивно ИП-клеток - на 612 и 1700% по отношению к контролю в случае 3-и 6-кратных воздействий УГГ соответственно (см. рис. 3, а, б, д, е). Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования выявили особенности влияния тяжелой повреждающей и нескольких, различающихся по кратности, режимов прекондиционирующей УГГ, а также их сочетанного воздействия на экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 в нейронах неокортекса и вентрального отдела гиппокампа. ТГ вызывает существенное подавление экспрессии Bcl-2 в неокортекса через 3 и 24 ч после ТГ. После 1-кратного ПК ТГ оказывает подобное же действие. В отличие от этого, многократные (3-и 6-кратные) сеансы ПК не только устраняют эти изменения, но и усиливают экспрессию Bcl-2 нейронами. В вентральном отделе гиппокампа (поля СА3/СА4), где в контроле наблюдаются единичные Bcl-2-экспрессирующие нейроны, как ТГ, так и ТГ после 1-кратного ПК, не оказывают влияния на Bcl-2-иммунореактивность. В то же время, ТГ вслед за многократным ПК вызывает активацию процесса экспрессии Bcl-2 нейронами. Ранее с использованием морфологических методов (окраски по Нисслю и выявлении апоптоза in situ) было показано, что ТГ индуцирует апоптоз множества нейронов исследуемых областей мозга, а 3-кратное ПК-воздействие в значительной мере предотвращает этот процесс [14, 15]. Недавно установлено, что 1-кратные, в отличие от 3-и 6-кратных, сеансы ПК с использованием УГГ не оказывают протективного воздействия на вызываемые ТГ структурные повреждения по типу апоптоза нейронов неокортекса и гиппокампа [3]. Сопоставление этих наблюдений с результатами настоящего исследования и данными литературы, свидетельствующими о важной роли Bcl-2 в регуляции апоптоза [5, 9, 10], позволяет сделать заключение о том, что, в отличие от 1-кратных, многократные воздействия гипоксического ПК способны запускать нейропротективные антиапоптотические внутриклеточные процессы. Установлено, что первые 2-4 ч после ишемического инсульта являются критическими для нарушения проницаемости митохондриальной мембраны и высвобождения из этих органелл цитохрома С с последующим запуском апоптотического каскада [4]. Одной из основных функций белка Bcl-2 является предотвращение этого процесса. Согласно нашим данным, уже через 3 ч после ТГ у крыс, подвергнутых многократному, но не 1-кратному ПК, отмечается высокий уровень содержания Bcl-2 в нейронах неокортекса и гиппокампа, что, очевидно, имеет важное значение для предотвращения запуска программы апоптоза и повреждения/гибели нейронов. Большой интерес представляют обнаруженные нами особенности влияния самого 1-и многократного ПК-воздействия на нейрональную Bcl2-экспрессию в исследуемых областях мозга. 3-, 6-кратные сеансы ПК, в отличие от 1-кратного, индуцируют активацию экспрессии в нейронах Bcl-2 к 24 ч после воздействия. Таким образом, многократные ПК-воздействия приводят к повышению содержания Bcl-2 в нейронах, и последующая ТГ протекает на этом фоне, что может способствовать формированию внутриклеточных защитных механизмов. Установлено, что, наряду с указанным выше механизмом протективного действия Bcl-2, этот белок вовлечен в контроль переноса Са2+ из эндоплазматической сети в митохондрии и предотвращение избыточного патологического накопления в них Са2+, которое приводит к нарушению функций этих органелл [11]. Как известно, экспрессия гена bcl-2 индуцируется рядом семейств транскрипционных факторов, в частности, активационными pCREB, NF-kB, а также рецепторами минералокортикоидов. Вероятно, обнаруженное нами усиление экспрессии Bcl-2 в ответ на многократные ПК-воздействия обусловлено вызываемой ими активацией этих транскрипционных факторов, что подтверждается ранее полученными данными об индуцированной 3-кратным ПК сверхэкспрессии в нейронах неокортекса и гиппокампа pCREB, NF-kB [1, 2, 13], а также рецепторов минералокортикоидов [12]. В то же время, 1-кратное ПК не оказывало такого действия [2]. В последнее время стал широко дискутироваться вопрос о возможном участии разных семейств микро-РНК, мишенями которых являются члены семейства генов bcl-2, в патологических и нейропротективных эффектах ишемии/ гипоксии [11]. Решение этого вопроса является перспективным для разработки новых способов нейропротекции. Таким образом, полученные данные убедительно свидетельствуют о важной роли антиапоптотичекого белка Bcl-2 в механизмах нейропротективных эффектов ПК-воздействия, индуцируемого многократными сеансами УГГ.

About the authors

A. V. Churilova

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: annch05@mail.ru
Laboratory of Regulation of Brain Neuron Functions

T. S. Glushchenko

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: tsgluschenko@mail.ru
Laboratory of Regulation of Brain Neuron Functions

M. O. Samoilov

RAS I. P.Pavlov Institute of Physiology

Email: samoilov@pavlov.infran.ru
Laboratory of Regulation of Brain Neuron Functions

References

Supplementary files