LIVER, LUNG, KIDNEY AND SPLEEN MACROPHAGES IN RATS AFTER INTRAVENOUS ADMINISTRATION OF THE MODIFIED MAGNETITE NANOPARTICLES

全文:

Наномерные частицы магнетита (НЧМ) могут использоваться как основа для создания магнитоуправляемых систем целевой доставки терапевтических и диагностических средств, как самостоятельные терапевтические агенты, а также как контрастные вещества при томографических исследованиях [5, 6, 10, 11]. Вследствие низкой коллоидной устойчивости и высокой повреждающей способности наноматериалов создание биомедицинской продукции возможно только на основе предварительно модифицированных НЧМ [8]. Поверхностная модификация наноматериалов изменяет их свойства (реакционную способность, стабильность и др.), позволяет получать биосовместимые наноконструкции для решения конкретных задач. Известно, что НЧМ при введении в организм животных накапливаются в мононуклеарных фагоцитах (МНФ) внутренних органов [4]. Вопрос о внутриклеточном преобразовании и сроках элиминации модифицированных НЧМ недостаточно разработан. Также неизвестны особенности реагирования макрофагов различных органов на введение таких наноконструкций. Цель данной работы - выявить особенности реагирования CD68+-и CD163+-макрофагов печени, легкого, почек и селезенки крыс на однократное внутривенное введение суспензии модифицированных (покрытых хитозаном и липидами) Материал и методы. Немодифицированные НЧМ были получены механохимическим способом в отделе структурной макрокинетики Томского научного центра СО РАН. НЧМ растворяли в водно-солевом стабилизирующем растворе (pH 7,4), содержащем хлорид натрия, цитрат натрия (РЕАХИМ, Россия) и динатриевую соль 4-(2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфониевой кислоты (AppliChem GmbH, Германия). Полученную суспензию подвергали сонификации, центрифугированию и экструзии. Суспензию магнитных микросфер готовили путем сорбции хитозана (Sigma Aldrich, Япония) на поверхности немодифицированных НЧМ. Магнитолипосомы получали путем экструзии через поликарбонатные фильтры суспензии немодифицированных НЧМ со смесью липидов: дипальмитоил-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфохолин (Lipoid GmbH, Германия), 1,2-дистеароил-глицеро-3-фосфоэтаноламин, холестерол и α-токоферола-ацетата (Avanti Polar Lipids, США). Исследование проведено на 320 половозрелых крысахсамцах линии CD, массой 200±30 г, которые были разделены на 6 групп: 1-я (n=40) - интактные животные - In; 2-я (n=40) - однократное внутривенное введение эмульсии полых липосом [160 мг(липидов)/кг массы тела, 4 мл] - HL; 3-я (n=40) - однократное внутривенное введение раствора хитозана [7,5 мг(хитозана)/кг, 3 мл] - CS; 4-я (n=40) - однократное внутривенное введение суспензии немодифицированных НЧМ [50 мг(Fe)/кг, 2 мл] - NМ; 5-я (n=80) - однократное внутривенное введение суспензии покрытых хитозаном НЧМ [50 мг(Fe)/кг, 3 мл] - MC; 6-я (n=80) - однократное внутривенное введение суспензии магнитолипосом на основе НЧМ [50 мг(Fe)/кг, 4 мл] - ML. Крыс содержали и выводили из эксперимента в соответствии с НЧМ. Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ № 755 от 12.08.1987 г.) и Федеральным Законом «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. Животных декапитировали под эфирным наркозом через 1, 7, 14, 21, 40, 60, 90 и 120 сут после инъекции, материал у животных всех групп брали в одно и то же время, фиксировали в 10% забуференном формалине (БиоВитрум, Россия, рН 7,4) в течение 24 ч при 4 ºС, затем промывали, проводили через абсолютный изопропиловый спирт (БиоВитрум, Россия) и переносили в парафиновую смесь «HISTOMIX» (БиоВитрум, Россия) [2]. Из парафиновых блоков на полуавтоматическом микротоме (Техном, Россия) готовили срезы толщиной 5 мкм, после их депарафинирования проводили высокотемпературную демаскировку антигенов в цитратном буфере (0,01 М, рН 6,0). Эндогенную пероксидазу блокировали, используя ингибитор «Hydrogen Peroxidase Bloke» (Thermo Scientific, Великобритания). На срезы наносили по 50 мкл предварительно разведенных первичных антител: CD68 (1:100, 30 мин) и CD163 (1:500, 30 мин). В работе использовали моноклональные мышиные антитела Novocastra и ThermoScientific, реагирующие с антигенами крысы. Дальнейшее иммуногистохимическое (ИГХ) выявление клеток проводили по протоколу системы визуализации «Novolink» (Leica, Австрия). Параллельно с выявлением антигенов проводили положительный и отрицательный контроль. Определяли количество CD68+-и CD163+-клеток на 1 мм2 среза органа. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «SPSS 11.5». Распределение на соответствие нормальному проверяли с помощью критерия Шапиро - Уилка (Shapiro - Wilk). Для выяснения значимости различий средних значений морфометрических показателей использовали однофакторный дисперсионный анализ для независимых выборок и однофакторный дисперсионный анализ повторных измерений для зависимых выборок. Результаты исследования. При ИГХреакции CD68+-и CD163+-клетки выявлены на срезах печени, легкого, почек и селезенки у крыс всех экспериментальных групп. В печени у животных интактной группы CD68+-и CD163+клетки расположены, главным образом, в стенке синусоидных капилляров. Единичные иммунопозитивные клетки встречаются в междольковой соединительной ткани. В легких у интактных крыс (1-я группа) иммунопозитивными являются некоторые клетки стромы органа и клетки, находящиеся в просвете альвеол. В интерстициальной соединительной ткани они расположены диффузно, часто перикапиллярно и преобладают над клетками, лежащими в просвете альвеол. В почках у интактных крыс ИГХ-маркеры идентифицированы в перикапиллярно расположенных клетках соединительной ткани преимущественно мозгового вещества. В селезенке интрафолликулярно располагаются единичные иммунопозитивные клетки (главным образом, CD68+). Основное количество клеток обоих ИГХ-классов определяется в селезеночных тяжах. CD163+-клетки в селезенке у всех групп животных преобладают над CD68+-клетками. Число иммунопозитивных клеток в селезенке у интактных животных не поддается подсчету в связи с их большой плотностью расположения и интенсивностью окраски, но представляется неизменным в течение всего эксперимента. Количество CD68+-и CD163+клеток в печени, легких и почках у интактных (In) крыс на протяжении эксперимента не изменяется (рис. 1, а, б). Интенсивность окраски CD68+клеток во всех изученных органах более выражена, чем CD163+-клеток. В печени, легких, почках и селезенке у животных 2-йи 3-й групп (HL и CS соответственно) не наблюдается изменений локализации иммунопозитивных клеток по сравнению с аналогичными органами у интактных крыс. Количество CD68+клеток в печени у крыс этих групп превосходит соответствующие показатели у интактных животных на 1-еи 7-е сутки, а CD163+-клеток - до 21-х (2-я группа) и 40-х (3-я группа) суток (см. рис. 1, а). CD163+-клетки окрашиваются визуально интенсивнее CD68+-клеток до 40-х (2-я группа) и до 60-х (3-я группа) суток. Количество CD68+клеток в легких у животных 2-йи 3-й групп увеличено по сравнению с таковым у интактных животных на 1-, 7-еи 14-е сутки (см. рис. 1, б), тогда как CD163+-клеток - на 1-еи 7-е сутки. Окраска CD163+-клеток визуально интенсивнее CD68+-клеток до 21-х (2-я группа) и до 14-х (3-я группа) суток. Количество CD68+-и CD163+клеток (2-я группа) и CD68+-клеток (3-я группа) в почках соответствует таковому у интактных крыс. Содержание CD163+-клеток в почках у крыс 3-й группы превосходит соответствующий показатель у интактных крыс на 1-, 7-, 14-еи 21-е сутки. Окраска CD163+-клеток представляется более интенсивной, чем CD68+-клеток до 40-х суток. Количество клеток обоих ИГХ-классов в селезенке увеличивается до 40-х суток у крыс 2-й и до 14-х суток у крыс 3-й группы. Количество CD68+-и CD163+-клеток в печени у крыс 4-й (NM) группы превышает их число у интактных животных на 1-еи 7-е сутки. С 7-х суток большое количество иммунопозитивных клеток выявляется в междольковой соединительной ткани. Количество CD68+-клеток - ниже с 14-х по 60-е сутки, а CD163+-клеток - выше до 40-х суток аналогичных показателей у интактных крыс (см. рис. 1, а). С 7-х по 40-е сутки наблюдается перераспределение клеток: количество CD68+-и CD163+-клеток увеличивается в области портальных трактов. К концу эксперимента количество иммунопозитивных клеток в междольковой соединительной ткани снижается. На 1-е и 7-е сутки в легких у крыс 4-й группы количество СD68+-иСD163+-клеток превосходит соответствующие показатели у животных интактной группы. C 7-х суток клетки обоих ИГХ-классов располагаются диффузно в интерстициальной соединительной ткани и составе периваскулярных инфильтратов. С 14-х суток иммунопозитивные клетки формируют перибронхиальные скопления без проникновения в собственную пластинку слизистой оболочки бронхов. С 14-х по 40-е сутки количество CD68+-и CD163+-клеток ниже, чем у интактных крыс (см. рис. 1, б). С 14-х суток происходит перераспределение CD68+-и CD163+клеток: в строме легкого их количество снижается, а расположенных интраальвеолярно - нарастает. На 40-е сутки описываемые клетки располагаются перибронхиально, образуя скопления в собственной пластинке слизистой оболочки бронхов. Количество CD68+-и CD163+-клеток в почках у крыс 4-й группы не отличается от такового у интактных крыс, а интенсивность их окраски на протяжении эксперимента одинакова. Количество и интенсивность окраски CD163+клеток в селезенке визуально преобладают над окраской CD68+-клеток с 1-х по 40-е сутки эксперимента. В течение 40 сут количество CD68+-и CD163+-клеток увеличено по сравнению с таковым у интактных животных. В печени у крыс 5-й (МС) группы количество CD68+-клеток увеличено на 1-еи 7-е сутки, а CD163+-клеток - на 1-, 7-, 14-еи 21-е сутки по сравнению с таковым у интактных крыс (см. рис. 1, а). Клетки обоих ИГХ-классов на 1-е сутки располагаются, главным образом, в стенке синусоидных капилляров (рис. 2), с 7-х по 14-е сутки их количество нарастает в междольковой соединительной ткани области триад. С 1-х по 40-е сутки CD163+-клетки визуально имеют более интенсивную окраску, чем CD68+-клетки. Количество CD68+-клеток в легких у крыс 5-й группы увеличено на 1-е сутки, ас 7-х по 40-е сутки - снижено по сравнению с показателями у интактных животных (см. рис. 1, б). Содержание CD163+-клеток выше на 1-, 7-е и 14-е сутки, ас 40-х суток - не отличается от такового у интактных животных. С 7-х по 21-е сутки наблюдается перераспределение иммунопозитивных клеток: количество клеток в просвете альвеол и бронхов нарастает, а в строме - снижается. Начиная с 7-х суток, появляются перибронхиальные скопления иммунопозитивных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки мелких бронхов. Количество CD68+-клеток в строме почек у крыс 5-й группы увеличено на 7-е сутки, а CD163+-клеток - с 1-х по 40-е сутки по сравнению с таковым у интактных крыс. В селезенке в красной и белой пульпе на 1-, 7-еи 14-е сутки визуально больше CD68+-и CD163+-клеток, чем у интактных животных. До 21-х суток окрашивание цитоплазмы CD163+-клеток представляется более интенсивным, чем CD68+-клеток. В печени у крыс 6-й (ML) группы количество CD68+-клеток превышает их численность у интактных животных на 1-еи 7-е сутки, а CD163+-клеток - с 1-х по 40-е сутки (см. рис. 1, а). Интенсивность окраски CD163+-клеток больше, чем CD68+-клеток на протяжении 40 сут. С 7-х по 14-е сутки увеличивается количество клеток, расположенных в междольковой соединительной ткани, главным образом, в области триад. На 1-е сутки в строме легкого обнаруживаются периваскулярные и перибронхиальные (без проникновения в собственную пластинку слизистой оболочки) инфильтраты, образованные мононуклеарными клетками (рис. 3). Количество CD68+-и CD163+-клеток на 1-е сутки превосходит таковое у интактных животных. С 7-х по 40-е сутки количество CD68+клеток в легких у крыс 6-й группы меньше, а численность CD163+-клеток - больше, чем у интактных крыс (см. рис. 1, б). Мононуклеарные клетки перибронхиальных инфильтратов проникают в собственную пластинку слизистой оболочки бронхов. До 40-х суток интенсивность окраски CD163+-клеток превосходит таковую CD68+клеток. Возрастание количества CD68+-клеток в почках у животных 6-й группы обнаружено только на 7-е сутки, тогда как CD163+-клеток - на 1-, 7-еи 14-е сутки по сравнению с таковым у интактных крыс. Интенсивность окраски CD68+-и CD163+-клеток в течение эксперимента одинакова. С 7-х по 2-е сутки количество CD68+-и CD163+-клеток в красной и белой пульпе селезенки визуально уменьшается. Обсуждение полученных данных. Для достоверной идентификации клеток при ИГХ-исследовании рекомендуется одновременно выявлять несколько маркеров. В работе использованы маркеры клеток системы МНФ (моноциты, незрелые и зрелые макрофаги). Локализация иммунопозитивных клеток в исследованных органах у животных характерна для макрофагов [1]. Цитоплазматическое и мембранное окрашивание хорошо согласуется с локализацией выявляемых молекул в клетках. CD68 - трансмембранный лизосомальный гликопротеин, относящийся к семейству LAMP (Lysosomal-Аssociated Мembrane Рrotein), экспрессируется на плазмолемме и цитоплазматических мембранах моноцитов и тканевых макрофагов. Слабая экспрессия CD68 (в порядке убывания) обнаруживается на гранулоцитах, лимфоцитах, фибробластах и эндотелиальных клетках [2]. CD163 - рецептор комплекса гаптоглобин-гемоглобин, участвующий в его эндоцитозе макрофагами, который экспрессируется на мембранах, главным образом, зрелых макрофагов. Система МНФ представлена во всех исследованных органах в разной степени, чем объясняются вариации количества клеток и интенсивности их окраски. Количество иммунопозитивных клеток на 1 мм2 среза органа у интактных крыс уменьшается в следующем ряду: селезенка, печень, легкие и почки. Кроме того, во всех изученных органах, кроме селезенки, у интактных крыс преобладают CD68+-клетки. У животных 2-йи 3-й групп наблюдаются признаки активации фагоцитов (увеличение количества, размеров и интенсивности окраски) [1], что свидетельствует об их участии в поглощении хитозана и фосфолипидов, изменения их локализации не происходит. Клетки ретикулоэндотелиальной системы и ее звена - МНФ [3] принимают активное участие в метаболизме НЧМ [4, 7, 8, 11]. Увеличение количества фагоцитов обоих ИГХ-классов в органах в ранние сроки после введения НЧМ может быть связано с дифференцировкой моноцитов или делением зрелых клеток [1]. На 1-е сутки у крыс 4-, 5-йи 6-й групп наблюдаются признаки активации макрофагов и их перемещение. Последующее снижение количества МНФ объясняется их способностью к активному перемещению, которая позволяет им покидать регион, в котором произошел фагоцитоз, а также гибелью клеток. В печени у крыс после введения суспензий НЧМ обнаруживается большое количество иммунопозитивных клеток обоих ИГХ-классов в междольковой соединительной ткани, тогда как у интактных крыс они располагаются, главным образом, в составе стенки синусоидных капилляров. После инъекции НЧМ в легких у крыс альвеолярные иммунопозитивные макрофаги доминируют над интерстициальными, в то время как у интактных животных в этом органе преобладают интерстициальные CD68+-и CD163+-МНФ. В почках и селезенке у крыс на фоне введения суспензий модифицированных НЧМ не наблюдается изменения локализации CD68+-и CD163+-макрофагов по сравнению с их расположением у интактных животных, а происходит лишь увеличение их количества. Перикапиллярное расположение макрофагов, видимо, способствует более эффективному поглощению ими НЧМ. Увеличение количества МНФ в просвете воздухоносных путей и перидуктально в печени в ранние сроки (7-21-е сутки) после введения НЧМ свидетельствует о миграции МНФ и возможных путях элиминации НЧМ из организма крыс [9]. Повышение гидрофильности НЧМ (в порядке увеличения): немодифицированные НЧМ, магнитолипосомы и магнитные микросферы ведет к увеличению стабильности их суспензий, приводит к более продолжительной циркуляции частиц и позволяет НЧМ выводятся почками [7, 9]. Нормализация количества, локализации и тинкториальных свойств МНФ изученных органов связана с выведением НЧМ. Гидрофильные НЧМ, модифицированные хитозаном, элиминируются быстрее, что обусловливает менее выраженные и непродолжительные изменения МНФ печени, легких, почек и селезенки у крыс этой группы. Стабилизация НЧМ углеводами препятствует агрегации частиц и снимает влияние на клетки их агломератов [7]. Магнитолипосомы, занимая по гидрофильности промежуточное положение между немодифицированными и модифицированными НЧМ, вызывают более существенную активацию системы МНФ, чем у животных 5-й группы, что объясняется присутствием в суспензии свободных, не покрытых липидами НЧМ. В почках у крыс система МНФ развита слабее, чем в других изученных органах, что подтверждается морфометрическими данными и относительно невысоким уровнем активации МНФ. Немодифицированные НЧМ (гидрофобные и агрегированные) не выводятся почками и не проникают в их интерстиций, в отличие от модифицированных, которые активируют CD68+-и CD163+-клетки органа. Повышение интенсивности окраски клеток после введения НЧМ связано с увеличением экспрессии CD-маркеров при активации клеток. Преобладание CD163+-клеток в селезенке у животных всех групп в течение эксперимента, в отличие от других органов, связано с активным участием её макрофагов в метаболизме гемового железа, об этом же свидетельствует расположение клеток, главным образом, в красной пульпе. Таким образом, инъекция немодифицированных НЧМ вызывает у крыс самые значительные и продолжительные количественные изменения МНФ печени, легкого и селезенки. Введение суспензии магнитолипосом сопровождается менее выраженными и продолжительными изменениями количества иммунопозитивных клеток. Введение модифицированных хитозаном НЧМ характеризуется наименьшими и краткосрочными изменениями количества МНФ в изученных органах.

作者简介

I. Mil’to

Siberian State Medical University; Tomsk National Research Polytechnic University

Email: milto_bio@mail.ru

参考

补充文件