AGE-RELATED PECULIARITIES OF THE NEURONS CONTAINING DIFFERENT TYPES OF CALCIUM-BINDING PROTEINS IN THE INTRAMURAL GANGLIA OF SMALL INTESTINE

Full Text

Са2+ является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке. Внутри-и внеклеточные сигналы могут приводить к кратковременному увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ в клетке [4, 8]. Связывание кальция сопровождается нарушением пространственной ориентации определенных групп белка и приводит к изменению его свойств. В настоящее время описаны Са-связывающие белки, содержащие в своей структуре от 2 до 6 Са-связывающих центров [4, 8, 15]. Наиболее распространенными в нервной системе являются кальбиндин (КБ) массой 28 килодальтон, кальретинин (КР) и парвальбумин, относящиеся к EF-семейству Са-связывающих белков. В зависимости от концентрации Са2+ последние по-разному взаимодействуют со своими белками-мишенями и регулируют их активность [8]. В автономной нервной системе сравнительно большая доля КБ-содержащих нейронов описана в симпатических узлах [2, 11] и метасимпатических интрамуральных узлах кишки [12, 13]. В подслизистом сплетении тонкой кишки у крысы около половины нейронов являются КР-позитивными [13]. Парвальбумин отсутствует в нейронах интрамуральных узлов пищеварительного тракта [7]. В нервной системе в онтогенезе относительное содержание различных типов Са-связывающих белков меняется. У крыс и кошек в ходе развития доля КБ-содержащих симпатических нейронов увеличивается с момента рождения до 10-х суток, затем снижается до конца 1-го месяца жизни [2, 11]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о возрастной динамике содержания КБ и КР в нейронах интрамуральных узлов кишки. Поэтому целью настоящего исследования явилось выявление локализации, относительного содержания и морфометрическая характеристика КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных узлах межмышечного сплетения двенадцатиперстной кишки у крыс разного возраста от момента рождения до старости. Материал и методы. Работа выполнена на крысахсамках линии Вистар в возрасте 1, 10, 20, 30, 60 сут, 1 года и 2 лет (по 5 животных в каждой возрастной группе). После введения летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально фосфатносолевым буфером (PBS) с гепарином, а затем 4% параформальдегидом на 0,1 М PBS рН 7,4. Исследовали двенадцатиперстную кишку. Выделенные участки кишки помещали на 2 ч в указанный выше фиксатор, далее 3-кратно промывали в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 ч, после чего на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. Нейроны, содержащие КБ и КР, выявляли при помощи меченых антител по ранее описанной методике [2, 11]. При этом использовали первичные антитела овцы (Abcam, США, разведение 1:500 и 1:100 соответственно), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом - флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США), дающим зеленую флюоресценцию. Для расчета относительного содержания иммунопозитивных нейронов, кроме мечения КБ и КР, проводили иммуномечение всей нейронной популяции при помощи моноклональных мышиных антител к протеиновому генному продукту 9,5 (Abcam, США, разведение 1:20), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом индокарбоцианином (Cy3, Jackson, США, разведение 1:100), дающим красную флюоресценцию. Срезы преинкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% сыворотки, 1% тритон X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч, отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Анализ препаратов проводили под флюоресцентным микроскопом Olympus BX43 (Olympus, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD-камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и относительного содержания иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info. nih.gov/ij/). Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с ядрышком. Для определения площади сечения нейронов в случайном порядке брали 100 нейронов, иммунопозитивных к каждому из исследованных маркеров в каждой возрастной группе. Статистический анализ включал определение среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при P<0,05. Результаты исследования. КБ-и КР-иммунопозитивные нейроны выявлялись в межмышечном сплетении двенадцатиперстной кишки у всех исследованных крыс от новорожденных до старых. Интенсивная флюоресценция отмечалась как в ядре, так и в цитоплазме нейронов (рисунок). У новорожденных крысят доля КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов была небольшой и не превышала 24 и 20,3% соответственно. Доля КР-иммунопозитивных нейронов увеличивалась в первые 10 сут жизни и далее значимо не изменялась, в том числе и у старых животных. Доля КБ-содержащих нейронов возрастала, достигая максимального значения к 20-м суткам жизни, незначительно снижаясь к 30-м суткам и далее значимо не менялась (табл. 1). Средняя площадь сечения КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов увеличивалась в онтогенезе с момента рождения в течение 1-го месяца жизни (табл. 2). При этом средний размер КБ-содержащих нейронов возрастал в 1,5 раза, а КР-позитивных - в 1,35 раза. Средний размер КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов значимо превышал среднюю площадь сечения иммунонегативных во всех возрастных группах (P<0,05). Значимых различий между средней площадью сечения КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов во всех возрастных группах не наблюдалось (P>0,05). Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что в первые 10 сут доля КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных узлах кишки увеличивается. Вероятно, это связано с важной ролью кальция в возрастных и стресс-индуцированных изменениях нервной системы [6, 8]. В интрамуральных узлах кишки у взрослой крысы почти половина нейронов содержат КБ и КР [12, 13], что согласуется с нашими данными. Однако у крыс в симпатических узлах и чувствительных узлах спинномозговых нервов содержание кальций-связывающих белков максимально у новорожденных и 10-суточных животных и снижается в раннем постнатальном онтогенезе. Значение такой гетерохронии остается пока неясным. Так же, как и в симпатических узлах, размеры нейронов в интрамуральных узлах возрастают в постнатальном онтогенезе. Однако средняя площадь сечения нейронов, в том числе КБ-и КР-содержащих, в интрамуральных узлах увеличивается в меньшей степени, чем в симпатических узлах [1, 3, 10]. Так же, как и в превертебральных симпатических узлах, КБ-иммунопозитивные нейроны крупнее иммунонегативных [11]. Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, важную роль играет поддержание определенной концентрации ионов кальция, которая может изменяться в пространстве и во времени, в частности, благодаря КБ и КР [8, 14]. При участии ионов кальция происходит регуляция роста развивающихся нейронов и морфологической пластичности конуса роста и развития дендритов, что совпадает по времени с увеличением содержания Са-связывающих белков [15]. На более поздних этапах постнатального развития нейронов интрамуральных узлов Са-связывающие белки играют роль кальциевых сенсоров и участвуют в поддержании концентрации кальция в клетках. КБ, связывая кальций, может регулировать внутриклеточные ответы на физиологические стимулы и защищать клетки от опосредованной кальцием нейротоксичности [9]. КБ играет также важную роль в защите клеток от апоптоза [5]. В литературе имеются данные о возрастном снижении экспрессии КБ, что делает клетки более чувствительными к измениям концентрации ионов кальция [6]. Однако результаты нашего исследования не подтверждают снижение содержания Са-связывающих белков в нейронах интрамуральных узлов метасимпатической нервной системы у старых животных. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе происходит увеличение доли КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральныхузлахкишки, чтопротивоположновозрастным изменениям содержания Са-связывающих белков в чувствительных узлах спинномозговых нервов и симпатических узлах. Окончательное созревание нейронов интрамуральных узлов, содержащих различные типы Са-связывающих белков, завершается к концу 1-го месяца жизни. Возрастной инволюции КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов межмышечного сплетения двенадцатиперстной кишки у старых крыс не отмечается.

About the authors

A. I. Yemanuilov

Yaroslavl’ State Medical Academy

K. Yu. Moiseyev

Yaroslavl’ State Medical Academy

I. V. Filippov

Yaroslavl’ State Medical Academy

P. M. Masliukov

Yaroslavl’ State Medical Academy

Email: mpm@yma.ac.ru

References

Supplementary files