ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙРОНОВ ИНТРАМУРАЛЬНЫХ УЗЛОВ ТОНКОЙ КИШКИ, СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ КАЛЬЦИЙ-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ

Полный текст

Са2+ является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке. Внутри-и внеклеточные сигналы могут приводить к кратковременному увеличению внутриклеточной концентрации Са2+ в клетке [4, 8]. Связывание кальция сопровождается нарушением пространственной ориентации определенных групп белка и приводит к изменению его свойств. В настоящее время описаны Са-связывающие белки, содержащие в своей структуре от 2 до 6 Са-связывающих центров [4, 8, 15]. Наиболее распространенными в нервной системе являются кальбиндин (КБ) массой 28 килодальтон, кальретинин (КР) и парвальбумин, относящиеся к EF-семейству Са-связывающих белков. В зависимости от концентрации Са2+ последние по-разному взаимодействуют со своими белками-мишенями и регулируют их активность [8]. В автономной нервной системе сравнительно большая доля КБ-содержащих нейронов описана в симпатических узлах [2, 11] и метасимпатических интрамуральных узлах кишки [12, 13]. В подслизистом сплетении тонкой кишки у крысы около половины нейронов являются КР-позитивными [13]. Парвальбумин отсутствует в нейронах интрамуральных узлов пищеварительного тракта [7]. В нервной системе в онтогенезе относительное содержание различных типов Са-связывающих белков меняется. У крыс и кошек в ходе развития доля КБ-содержащих симпатических нейронов увеличивается с момента рождения до 10-х суток, затем снижается до конца 1-го месяца жизни [2, 11]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о возрастной динамике содержания КБ и КР в нейронах интрамуральных узлов кишки. Поэтому целью настоящего исследования явилось выявление локализации, относительного содержания и морфометрическая характеристика КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных узлах межмышечного сплетения двенадцатиперстной кишки у крыс разного возраста от момента рождения до старости. Материал и методы. Работа выполнена на крысахсамках линии Вистар в возрасте 1, 10, 20, 30, 60 сут, 1 года и 2 лет (по 5 животных в каждой возрастной группе). После введения летальной дозы уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно) животных перфузировали транскардиально фосфатносолевым буфером (PBS) с гепарином, а затем 4% параформальдегидом на 0,1 М PBS рН 7,4. Исследовали двенадцатиперстную кишку. Выделенные участки кишки помещали на 2 ч в указанный выше фиксатор, далее 3-кратно промывали в PBS в течение 30 мин и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 ч, после чего на криостате готовили серии срезов толщиной 14 мкм. Нейроны, содержащие КБ и КР, выявляли при помощи меченых антител по ранее описанной методике [2, 11]. При этом использовали первичные антитела овцы (Abcam, США, разведение 1:500 и 1:100 соответственно), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом - флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC, разведение 1:100, Jackson Immunoresearch, США), дающим зеленую флюоресценцию. Для расчета относительного содержания иммунопозитивных нейронов, кроме мечения КБ и КР, проводили иммуномечение всей нейронной популяции при помощи моноклональных мышиных антител к протеиновому генному продукту 9,5 (Abcam, США, разведение 1:20), вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом индокарбоцианином (Cy3, Jackson, США, разведение 1:100), дающим красную флюоресценцию. Срезы преинкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в PBS с добавлением 10% сыворотки, 1% тритон X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,05% тимерозола. Затем срезы инкубировали с первичными антителами в течение 24 ч при комнатной температуре. После кратковременной промывки в PBS срезы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч, отмывали в PBS и заключали в среду для иммунофлюоресценции (VectaShield, Vector Laboratories, США). Анализ препаратов проводили под флюоресцентным микроскопом Olympus BX43 (Olympus, Япония) с соответствующим набором светофильтров и охлаждаемой цифровой CCD-камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Для анализа размеров и относительного содержания иммунопозитивных нейронов на цифровых изображениях гистологических препаратов использовали программу Image J (NIH, США, http://rsb.info. nih.gov/ij/). Долю иммунопозитивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с ядрышком. Для определения площади сечения нейронов в случайном порядке брали 100 нейронов, иммунопозитивных к каждому из исследованных маркеров в каждой возрастной группе. Статистический анализ включал определение среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине t-критерия Стьюдента и считали их значимыми при P<0,05. Результаты исследования. КБ-и КР-иммунопозитивные нейроны выявлялись в межмышечном сплетении двенадцатиперстной кишки у всех исследованных крыс от новорожденных до старых. Интенсивная флюоресценция отмечалась как в ядре, так и в цитоплазме нейронов (рисунок). У новорожденных крысят доля КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов была небольшой и не превышала 24 и 20,3% соответственно. Доля КР-иммунопозитивных нейронов увеличивалась в первые 10 сут жизни и далее значимо не изменялась, в том числе и у старых животных. Доля КБ-содержащих нейронов возрастала, достигая максимального значения к 20-м суткам жизни, незначительно снижаясь к 30-м суткам и далее значимо не менялась (табл. 1). Средняя площадь сечения КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов увеличивалась в онтогенезе с момента рождения в течение 1-го месяца жизни (табл. 2). При этом средний размер КБ-содержащих нейронов возрастал в 1,5 раза, а КР-позитивных - в 1,35 раза. Средний размер КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов значимо превышал среднюю площадь сечения иммунонегативных во всех возрастных группах (P<0,05). Значимых различий между средней площадью сечения КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов во всех возрастных группах не наблюдалось (P>0,05). Обсуждение полученных данных. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что в первые 10 сут доля КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральных узлах кишки увеличивается. Вероятно, это связано с важной ролью кальция в возрастных и стресс-индуцированных изменениях нервной системы [6, 8]. В интрамуральных узлах кишки у взрослой крысы почти половина нейронов содержат КБ и КР [12, 13], что согласуется с нашими данными. Однако у крыс в симпатических узлах и чувствительных узлах спинномозговых нервов содержание кальций-связывающих белков максимально у новорожденных и 10-суточных животных и снижается в раннем постнатальном онтогенезе. Значение такой гетерохронии остается пока неясным. Так же, как и в симпатических узлах, размеры нейронов в интрамуральных узлах возрастают в постнатальном онтогенезе. Однако средняя площадь сечения нейронов, в том числе КБ-и КР-содержащих, в интрамуральных узлах увеличивается в меньшей степени, чем в симпатических узлах [1, 3, 10]. Так же, как и в превертебральных симпатических узлах, КБ-иммунопозитивные нейроны крупнее иммунонегативных [11]. Среди факторов, регулирующих развитие синапсов и их пластичность, важную роль играет поддержание определенной концентрации ионов кальция, которая может изменяться в пространстве и во времени, в частности, благодаря КБ и КР [8, 14]. При участии ионов кальция происходит регуляция роста развивающихся нейронов и морфологической пластичности конуса роста и развития дендритов, что совпадает по времени с увеличением содержания Са-связывающих белков [15]. На более поздних этапах постнатального развития нейронов интрамуральных узлов Са-связывающие белки играют роль кальциевых сенсоров и участвуют в поддержании концентрации кальция в клетках. КБ, связывая кальций, может регулировать внутриклеточные ответы на физиологические стимулы и защищать клетки от опосредованной кальцием нейротоксичности [9]. КБ играет также важную роль в защите клеток от апоптоза [5]. В литературе имеются данные о возрастном снижении экспрессии КБ, что делает клетки более чувствительными к измениям концентрации ионов кальция [6]. Однако результаты нашего исследования не подтверждают снижение содержания Са-связывающих белков в нейронах интрамуральных узлов метасимпатической нервной системы у старых животных. Таким образом, в раннем постнатальном онтогенезе происходит увеличение доли КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов в интрамуральныхузлахкишки, чтопротивоположновозрастным изменениям содержания Са-связывающих белков в чувствительных узлах спинномозговых нервов и симпатических узлах. Окончательное созревание нейронов интрамуральных узлов, содержащих различные типы Са-связывающих белков, завершается к концу 1-го месяца жизни. Возрастной инволюции КБ-и КР-иммунопозитивных нейронов межмышечного сплетения двенадцатиперстной кишки у старых крыс не отмечается.

Об авторах

Андрей Игоревич Емануйлов

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра анатомии человека 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Константин Юрьевич Моисеев

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Игорь Владимирович Филиппов

Ярославская государственная медицинская академия

кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Петр Михайлович Маслюков

Ярославская государственная медицинская академия

Email: mpm@yma.ac.ru
кафедра нормальной физиологии 150000, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Список литературы

Дополнительные файлы