DYNAMICS OF CHANGES IN THE NUMERICAL DENSITY OF PLACENTAL MACROPHAGES DURING UROGENITAL INFECTION IN EARLY PREGNANCY

Full Text

При физиологически протекающей беременности базальная децидуальная оболочка (БДО) содержит различные виды лейкоцитарных и нелейкоцитарных клеток, среди которых доминируют клетки врожденной иммунной системы [5, 10]. Их присутствие в БДО означает, что система врожденного иммунитета матери, во-первых, не безразлична к полуаллогенному плоду, а во-вторых, способна инициировать врожденный иммунный ответ в случае инфицирования. Децидуальные макрофаги, имеющие материнское происхождение, при наступлении беременности приобретают специфический фенотип и являются первыми клетками, способными распознавать продукты жизнедеятельности патогенных микроорганизмов за счет активации на их поверхности Толл-подобных рецепторов [13]. Дисфункция макрофагов или изменения их содержания в БДО могут приводить к нарушениям в процессе инвазии цитотрофобласта и формирования плаценты, к изменениям толерантности материнского организма к полуаллогенному трофобласту с развитием осложнений беременности и ее прерыванием [5, 10]. В строме ворсин хориона в ранние сроки беременности единственной популяцией иммунокомпетентных клеток являются клетки Кащенко- Гофбауэра (ККГ), экспрессирующие высокие уровни регуляторных цитокинов и способные участвовать в неспецифических защитных реакциях в плаценте [4, 13]. Однако отраженные в литературе сведения, свидетельствующие о реактивности макрофагов плодного происхождения при инфекции, довольно противоречивы. Так, при инфекционном хорионамнионите отмечалось снижение количества макрофагов в ворсинах хориона [14]. При хорионамнионитах и виллузитах неизвестной этиологии, а также ряде других патологических состояний, напротив, было описано увеличение численной плотности ККГ [8, 12, 13]. Кроме того, при развитии ворсинчатого хориона ККГ способствуют иммуносупрессии в зоне имплантации зародыша, обеспечивая его толерантность к антигенам матери [13]. Таким образом, несмотря на неодинаковое происхождение макрофагов (материнские, фетальные) и расположение их в разных участках плаценты (БДО, строма ворсинчатого хориона), очевидна их единая роль в обеспечении защитной функции при воспалительных процессах во время беременности. Цель данной работы - исследовать численную плотность макрофагов в БДО и ворсинах хориона в зависимости от вида урогенитального инфицирования. Материал и методы. Объектом исследования служили образцы БДО и ворсинчатого хориона (n=136), полученные после артифициальных абортов по немедицинским показаниям на 6-8-й неделе беременности у женщин, поступивших в гинекологическое отделение родильного дома № 1 г. Томска. Исследования были одобрены этическим комитетом Сибирского государственного медицинского университета Росздрава (протокол заседания № 1278 от 01.03.2010 г.) и проводились с письменного согласия пациенток. Материал был получен от пациенток, которых разделили на следующие группы: 1-я (n=66) - беременные женщины без уреаплазменного, микоплазменного и хламидийного инфицирования (контрольная); 2-я (n=18) и 3-я (n=16) - беременные женщины, инфицированные Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis (соответственно); микробное число во 2-йи 3-й группах составило больше 104 КОЕ; 4-я (n=24) - беременные женщины с активной формой хламидиоза; 5-я (n=12) - женщины с персистентной формой хламидиоза. Идентификацию уреаплазм, микоплазм и хламидий осуществляли методом ПЦР при исследовании соскобов эпителия уретры и цервикального канала. Критерием диагностики персистентной формы хламидийной инфекции являлось обнаружение в сыворотке крови антител класса G к белку теплового шока HSP60 С. trachomatis. При активной форме хламидиоза антитела к HSP60 хламидий не обнаруживаются. Женщин, включенных в настоящее исследование, несмотря на присутствие инфекционных агентов, клинические проявления не беспокоили. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и по общепринятой методике заливали в парафин. Срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином - эозином, а также проводили иммуногистохимическое исследование при помощи поликлональных антител к маркеру макрофагов - CD68 (DakoCytomation, Дания, разведение 1:100), для чего применяли двухэтапный авидинбиотиновый метод с высокотемпературной демаскировкой антител согласно стандартному протоколу. Визуализацию экспрессии осуществляли с использованием набора EnVision Detection System (DakoCytomation, Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Для оценки численной плотности CD68-позитивных клеток на 1 мм2 среза БДО и ворсинчатого хориона применяли окулярную вставку с известной площадью при об. 90, ок. 10. Подсчет клеток в строме ворсин осуществляли в 10 независимых полях зрения. Количественную оценку структурных компонентов ворсинчатого хориона проводили с помощью окулярной сетки с 50 тестовыми точками. Для этого при об. 90, ок. 10 в 10 независимых полях зрения подсчитывали количество точек, приходящихся на строму, сосуды и эпителий ворсин хориона. Затем по соотношению точек определяли удельный объем (в %) каждой из указанных структур, принимая за 100 общее количество точек. Просматривали и фотографировали микропрепараты с помощью микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия). Cтатистическую обработку количественных данных проводили, используя компьютерные программы SPSS 11.5, и анализировали методами описательной статистики с вычислением медианы (Ме) и интерквартильного интервала (Q25%- ). Для оценки различий между показателями в группах Q75%использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считали значимыми при P<0,05, при 0,056≤P≤0,060 высказывались о тенденции. Результаты исследования. При инфицировании Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis в БДО наблюдалась сходная морфологическая картина. Строма была представлена пластами компактно расположенных децидуальных клеток, среди которых преобладали промежуточные и зрелые формы. Спиральные артерии подвергались гестационной перестройке, характеризующейся инвазией цитотрофобласта в их стенку с замещением мышечных и эластических элементов фибриноидом и расширением просвета. Нередко наблюдалось полное закрытие просвета артерий клетками цитотрофобласта. CD68позитивные макрофаги диффузно располагались среди децидуальных клеток, имели вытянутую или отростчатую форму, крупное гиперхромное ядро (рисунок, а). При активной и персистентной формах хламидиоза децидуальные клетки в БДО располагались на расстоянии друг от друга в связи с отеком стромы. Спиральные артерии характеризовались начальными признаками ремоделирования, что проявлялось незначительным фибриноидным набуханием их стенок, отсутствием в последних инвазии цитотрофобласта. CD68-позитивные макрофаги были диффузно расположены между децидуальными клетками (см. рисунок, б), с некоторым преобладанием вокруг спиральных артерий и желез эндометрия. Ворсинчатый хорион при уреаплазменном и микоплазменном инфицировании был представлен в основном промежуточными незрелыми ворсинами, в соединительной ткани которых в промежутках между отростчатыми клетками (в сети стромальных каналов) свободно располагались CD68-позитивные ККГ (см. рисунок, в). Эти клетки имели преимущественно овальную или круглую форму, мелковакуолизированную цитоплазму и эксцентрично расположенное ядро. Поверхность ворсин покрывал слой цито-и синцитиотрофобласта. При активной и персистентной форме хламидиоза в ворсинчатом хорионе наблюдался очаговый тромбоз межворсинчатого пространства, преобладали незрелые промежуточные ворсины с дистрофией и деструкцией синцитиотрофобласта на поверхности отдельных ворсин. ККГ свободно размещались в стромальных каналах, однако их содержание при хламидийной инфекции было меньше, чем в других исследованных группах (см. рисунок, г). В численной плотности CD68-позитивных клеток в БДО и ворсинчатом хорионе при разных видах урогенитального инфицирования были обнаружены следующие различия (табл. 1). Так, содержание макрофагов в БДО не различалось в исследованных группах. В строме ворсинчатого хориона численная плотность ККГ была снижена в 1,3 раза при уреа-и микоплазменном инфицировании и в 1,5-1,8 раза - при персистентной и активной форме хламидиоза (соответственно) по сравнению с показателями в контрольной группе. Количественная оценка удельного объема различных структур ворсинчатого хориона при инфицировании условно-патогенной и патогенной урогенитальной микрофлорой также выявила отличия от значений в контрольной группе (табл. 2). При этом уреа-и микоплазменное инфицирование нижних отделов половых путей характеризовалось пролиферацией трофобластического эпителия, стромы и сосудов ворсин. В условиях хламидиоза морфологические изменения проявлялись более низким удельным объемом стромы, сосудов и эпителия ворсин, чем в контрольной группе. Обсуждение полученных данных. В ранее опубликованных работах были представлены данные, характеризующие количественное содержание CD68-позитивных клеток в БДО и ворсинчатом хорионе при инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, которая является облигатным внутриклеточным патогенным микроорганизмом для человека [1, 3]. Результаты, обобщенные в настоящем исследовании, позволили сравнить изменения численной плотности макрофагов плаценты при инфицировании беременных женщин патогенной и условно-патогенной (Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis) микрофлорой. Так, присутствие патогенной микрофлоры не вызывало изменений в численной плотности CD68-позитивных клеток в БДО, при этом наблюдалось замедление гестационной перестройки стромы и сосудов, сопровождаемое отставанием в развитии ворсинчатого хориона и низкой численной плотностью ККГ. Известно, что при физиологической беременности макрофаги, локализованные в БДО, характеризуются низким уровнем провоспалительных цитокинов, продукцией различных иммунорегуляторных молекул, которые паракринным способом регулируют пролиферацию и рост цитотрофобласта в ранние сроки беременности, обеспечивают толерантность материнского организма к трофобластическим клеткам, детерминируют дифференцировку наивных Т-лимфоцитов в сторону Th2-иммунного ответа, специфичного для беременности [7, 9]. Очевидно, что присутствие микроорганизмов должно было вызвать соответствующую реакцию клеток, обеспечивающих врожденный иммунитет с увеличением их численной плотности, однако этого не происходило. Объяснением могут служить результаты предыдущих исследований, которые позволили установить отчетливо выраженную экспрессию Толл-подобных рецепторов (TLR2) на поверхности CD68-позитивных клеток БДО при хламидиозе, указывающую на активацию макрофагов в ответ на присутствие хламидий [1]. При этом, защитная реакция макрофагов БДО реализуется не за счет увеличения их количества, а путем активации распознающих рецепторов на поверхности клеток. Вероятно, это является начальным этапом развития воспалительного процесса в БДО при хламидиозе. При инфицировании условно-патогенной микрофлорой с высоким микробным числом были получены несколько иные результаты: при том, что численная плотность макрофагов в БДО не изменялась, гестационная трансформация БДО явно опережала таковую в контрольной группе. В исследованиях, проведенных и опубликованных ранее, мы установили, что при уреаплазменном инфицировании происходит незначительное увеличение числа TLR2-позитивных макрофагов в БДО, а при микоплазменном - его уменьшение [2, 3]. Полученные результаты могли быть связаны с непосредственным повреждением клеточной мембраны и поверхностного рецепторного аппарата макрофагов уреа-и микоплазмами, результатом чего являлась неадекватная реакция макрофагов на присутствие микроорганизмов. Обтурация спиральных артерий цитотрофобластом способствовала развитию местной гипоксии, являющейся, как известно, важным стимулятором роста ворсинчатого хориона в ранние сроки беременности [6]. Как следствие, наблюдалось разрастание всех структур, составляющих ворсинчатое древо, в изучаемом периоде гестации. Логично было бы ожидать увеличения численной плотности ККГ, которого, однако, не наблюдалось. Учитывая важную роль ККГ в формировании соединительнотканной стромы и сосудов [11], можно утверждать, что макрофаги ворсин даже при их сниженной численной плотности успешно справляются с функцией формирования ворсинчатого древа. Причина снижения численной плотности ККГ при инфицировании условнопатогенной микрофлорой остается неясной и требует дальнейших исследований. Таким образом, при разных видах урогенитального инфицирования численная плотность макрофагов в БДО не изменяется, а в строме ворсин хориона - снижается по сравнению с таковой в группе контроля. Несмотря на отсутствие явных признаков воспаления в маточно-плацентарной области, при инфицировании патогенной и условно-патогенной микрофлорой изменяется скорость гестационной трансформации БДО и формирования ворсинчатого хориона, что в более поздние сроки беременности может приводить к развитию плацентарной недостаточности.

About the authors

L. R. Mustafina

Siberian State Medical University; Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Perinatology of RAS Siberian Branch Tomsk Scientific Center

Email: mustafinalr@rambler.ru

S. V. Logvinov

Siberian State Medical University

S. Yu. Yuriyev

Siberian State Medical University

References

Supplementary files