Distribution of connexin 43 in the human pineal gland

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Шишковидная железа (эпифиз мозга) — непарная железа внутренней секреции — одно из самых крупных образований эпиталамуса. Мелатонин является основным гормоном, вырабатываемым эпифизом мозга, цикличный синтез и секреция которого влияют на работу многих внутренних органов [1, 2]. Среди основных функций шишковидной железы выделяют регуляцию цикла бодрствование–сон; влияние на репродуктивную функцию, иммунитет; реакцию организма на стресс; антиоксидантную и нейропротекторную функции [3]. Большинство клеток шишковидной железы (около 90%) составляют синтезирующие мелатонин нейроэндокринные клетки — пинеалоциты. Вторую по численности популяцию составляют астроциты, которые важны в поддержании функционирования пинеалоцитов. В эпифизе также встречаются клетки микроглии [4].

Коннексин 43 (Cx43) является одним из основных белков щелевых контактов астроцитов. Исследование распределения Cx43 представляет особый интерес для выяснения характера функционального взаимодействия клеток [5]. Имеющиеся на сегодняшний день данные однозначно указывают, что щелевые контакты в эпифизе мозга позвоночных животных существуют — это показано с помощью электронной микроскопии для многих видов млекопитающих [6–8], а также у птиц [9] и рыб [10]. Относительно щелевых контактов в шишковидной железе человека на сегодня известно, что они присутствуют между пинеалоцитами в шишковидной железе у эмбрионов [11], а в эпифизе мозга у взрослых выявлена только экспрессия гена коннексина 36 [12]. Исследование Cx43 в шишковидной железе человека ранее не проводилось.

Цель исследования — изучить распределение щелевых контактов в шишковидной железе человека с применением методики одновременного выявления коннексина 43 и маркёра астроцитов — глиального фибриллярного кислого белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили образцы эпифиза человека (n=4), полученные из архива Отдела общей и частной морфологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины». Возраст обследуемых составил от 19 до 34 лет. На проведение исследования получены положительные заключения локального этического комитета ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» № 58-9/1-684 от 11.12.2009 и № 2/22 от 06.04.2022. Образцы эпифиза были зафиксированы в этанол-формалине и залиты в парафин по общепринятой методике [13]. На ротационном микротоме Rotary 3003 PFM (PFM Medical, Германия) изготавливали срезы толщиной 7 мкм и приклеивали на стёкла с адгезивным покрытием HistoBond+M (Paul Marienfeld GmbH & Co., Германия).

Перед отработкой методики двойного иммуноокрашивания срезы эпифиза мозга человека исследовали с применением иммунопероксидазной метки к Cx43 для микроскопии в проходящем свете. На этом этапе подбирали первичные антитела и их концентрацию, а также отрабатывали методику (подбор буфера и время) демаскирования антигена. Протестированы следующие антитела к Cx43 фирмы Santa Cruz Biotechnology (США): мышиные моноклональные антитела (клон F-7) (кат. номер sc-271837) и козьи поликлональные антитела (C20) (кат. номер sc-6560). В качестве контроля использовали парафиновые срезы миокарда человека. На основании полученных результатов заключили, что высокоспецифическая реакция и отсутствие фона наблюдаются при использовании мышиных моноклональных антител (клон F-7). Препараты ткани эпифиза человека обрабатывали согласно следующему протоколу: срезы после процедуры депарафинирования, где в качестве растворителя был использован ортоксилол, и регидратации подвергали тепловому демаскированию в свежеприготовленном предварительно нагретом до 60 °С 10% водном растворе тиосульфата натрия (pH=9,0) (патент № RU 2719163C1) в течение 23 мин в пароварке. Остывшие предметные стекла промывали дистиллированной водой в течение 5 мин и помещали в 3% водный раствор перекиси водорода для блокировки эндогенной пероксидазы. Далее промывали срезы в свежем 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) (pH=7,4) («БиолоТ», Россия) и оставляли при комнатной температуре на 5 мин. Для того чтобы антитела не растекались по стеклу, вокруг срезов формировали поле с помощью гидрофобного карандаша Dako Pen (Dako, Дания). После этого на препараты наносили необходимое для покрытия срезов количество блокировочного раствора Protein Block (Spring Bioscience, США) и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Затем стряхивали излишек блокировочного раствора и, не промывая, наносили необходимое количество мышиных моноклональных антител к Cx43 (клон F-7) (sc-271837, Santa Cruz Biotechnology, США) в разведении 1:600, а после инкубировали во влажной камере при 27,5 °С в течение 2 сут. В качестве вторичных антител применяли систему Histiofine Mousestain Kit (425312F; Nichirei, Япония). Препараты инкубировали во влажной камере в термостате при 27,5 °С в течение 30 мин, затем промывали в фосфатно-солевом буфере и оставляли в свежей порции буфера на 5 мин при комнатной температуре. Далее препараты обрабатывали рабочим раствором 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорида (из набора DAB+) (Dako, Дания). После промывки в трёх сменах дистиллированной воды препараты обезвоживали по стандартной методике и заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific, США). Анализ и фотографирование полученных срезов проводили на световом микроскопе Leica DM750 (Leica Microsystems, Германия), оснащённом фотокамерой ICC50 (Leica Microsystems, Германия). Применяли программу обработки изображений LAS EZ (Leica Microsystems, Германия).

Для постановки двойной иммуногистохимической реакции процедура обработки препаратов включала в себя описанные выше этапы (за исключением обработки перекисью водорода). После обработки препаратов блокировочным раствором Protein Block (Spring Bioscience, США) в течение 10 мин его излишек стряхивали и, не промывая, наносили необходимый объём смеси (1:1) первичных антител — мышиные моноклональные антитела к Cx43 (клон F-7) (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведении 1:100 и кроличьи поликлональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (кат. номер Z0334; Dako/Agilent, США) в разведении 1:100. Смесь первичных антител аккуратным покачиванием распределяли по всему срезу. Препараты инкубировали во влажной камере в термостате при 27,5 °С в течение 4 сут. Затем препараты промывали с помощью PBS и помещали в свежую порцию буфера на 5 мин при комнатной температуре. После этого на препараты наносили моновалентный Fab-фрагмент антикроличьего иммуноглобулина осла, конъюгированный с флуорохромом Rhodamine Red-X (RRX) (кат. номер 711-295-152; Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:25) и инкубировали во влажной камере в термостате при 27,5 °С в течение 1,5 ч. Затем в данный раствор вторичных антител добавляли лошадиные антимышиные антитела, конъюгированные с биотином (кат. номер BA-2001; Vector Laboratories, США; разведение 1:200) так, чтобы соотношение объёмов антител стало 1:1, и инкубировали еще 2,5 ч в термостате при 27,5 °С. Далее препараты промывали раствором PBS, помещали в свежую порцию PBS и убирали в темноту на 5 мин при комнатной температуре. Для выявления биотинилированных антител на срезы наносили конъюгат стрептавидина с флуорохромом Cy2 (кат. номер 016-220-084; Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:100) и инкубировали в течение 40 мин в термостате при 27,5 °С. Затем препараты промывали в растворе PBS, помещали в дистиллированную воду и оставляли на 5 мин при комнатной температуре. На следующем шаге срезы обезвоживали в отдельно приготовленной батарее для флуоресцентно окрашенных препаратов, которая включает в себя несколько этапов: две смены изопропилового спирта по 1 мин, смесь изопропилового спирта и ксилола (1:1 — 1 мин), две смены ксилола по 1 мин. Далее препараты заключали в перманентную среду Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific, США). Препараты хранили в темноте при комнатной температуре до проведения микроскопии.

Исследование полученных препаратов выполняли при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM 800 (Carl Zeiss, Германия), оснащённого системой Airyscan. Флуоресценцию индуцировали лазерами с длиной волны 488 нм (для флуорохрома Cy2) и 561 нм (для флуорохрома RRX). Была использована комбинация фильтров MBS 488/561. Пользовались объективами Plan Apochromat 20×/0.8 M27 и Plan Apochromat 63×/1.40 Oil DICM27 (Nikon, Япония) (масляная иммерсия). Обработку полученных изображений и построение трёхмерных реконструкций проводили в общедоступной программе ZEN 2.6 (Carl Zeiss, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Иммуногистохимическое исследование препаратов показало, что белок Cx43 щелевых контактов широко представлен в шишковидной железе человека. При этом Cx43-иммуноположительные структуры не имели типичного гранулярного характера распределения, а выявлялись как линейные структуры. Иммуноположительные «волокна» наблюдались как в области соединительнотканных трабекул, так и в дольках эпифиза мозга. Cx43-иммунореактивность была распределена в шишковидной железе неравномерно. Как правило, Cx43-иммуноположительные структуры локализовались по периферии органа. Яркая реакция прослеживалась вдоль внешней границы эпифиза мозга, сформированной отростками астроцитов. Часто наблюдались кровеносные сосуды в трабекулах, вокруг которых концентрировалось большое количество волокноподобных структур с яркой реакцией на исследуемый белок (рис. 1, a). В паренхиме шишковидной железы встречались области c большим количеством Cx43-иммуноположительных структур, и области, где их было значительно меньше, и они локализовались разрозненно (рис. 1, a, b).

 

Рис. 1. Распределение щелевых контактов в эпифизе мозга человека. Иммуногистохимическая реакция на Cx43: a — большое количество Cx43-иммуноположительных структур в области кровеносных сосудов; b — разрозненная локализация щелевых контактов в трабекулах и в паренхиме шишковидной железы. Бар — 20 мкм; звёздочкой обозначен кровеносный сосуд; стрелки указывают на Cx43-иммуноположительные структуры.

Fig. 1. Distribution of gap junctions in the human brain pineal gland. Immunohistochemical reaction to Cx43: a — a large number of Cx43-immunopositive structures in the area of blood vessels; b — scattered localization of gap junctions in trabeculae and in the parenchyma of the pineal gland. Bar — 20 microns; an asterisk indicates a blood vessel; arrows indicate Cx43-immunopositive structures.

 

При исследовании флуоресцентно окрашенных препаратов установлено, что Cx43 локализовался как в телах, так и в отростках GFAP-иммунореактивных астроцитов шишковидной железы в виде округлых гранул (рис. 2). Даже в тех областях, где плотность распределения астроцитов была высокой, Cx43 локализовался дискретно, в виде отдельных единичных кластеров флуоресцирующих бляшек размером 0,3–1,5 мкм. Часто встречались GFAP-иммунореактивные астроциты, в которых реакция на Cx43 отсутствовала.

 

Рис. 2. Локализация щелевых контактов в астроцитах шишковидной железы человека. Двойная иммуногистохимическая реакция на Cx43 (зелёная флуоресценция) и GFAP (красная флуоресценция). Конфокальная лазерная микроскопия: a — локализация щелевых контактов в телах и отростках астроцитов, одиночный оптический срез; b — увеличенный фрагмент рисунка 2, a. К — кальцификат. Стрелки указывают на скопления Cx43-иммуноположительных щелевых контактов.

Fig. 2. Localization of gap junctions in human pineal astrocytes. Double immunohistochemical reaction for Cx43 (green fluorescence) and GFAP (red fluorescence). Confocal laser microscopy: a — localization of gap junctions in the bodies and processes of astrocytes, single optical section; b — enlarged fragment of Figure 2, a. K — calcification. Arrows indicate clusters of Cx43-immunopositive gap junctions.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведённого исследования удалось получить новые данные о распределении Сх43-иммунопозитивных структур в эпифизе мозга человека. Интересно отметить, что при выявлении Cx43 с применением пероксидазной метки индивидуальные гранулярные структуры в шишковидной железе человека не определяются, в отличие от ткани головного мозга крысы [14]. Результат иммуногистохимического окрашивания, по-видимому, зависит от многих факторов, связанных с обработкой материала и способом его фиксации [15]. Возможно, отсутствие дискретного характера распределения Cx43 в эпифизе мозга человека может быть связано с низким разрешением по оси Z в случае использования микроскопии в проходящем свете. Кроме того, результат может зависеть и от соотношений мембранной и цитоплазматической локализации исследуемого маркёра [16]. Так, в настоящем исследовании показано, что проблема выявления дискретного характера распределения щелевых контактов в шишковидной железе человека может быть решена с применением метода конфокальной лазерной микроскопии. Данный результат определяется тем, что конфокальный микроскоп позволяет устанавливать диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального светового пятна дифракционной картины точечного объекта (диска Эйри) и исключать попадание в объектив света от дифракционных колец. Это даёт возможность повысить разрешающую способность в 1,4 раза по сравнению с обычными светооптическими микроскопами [17, 18], что в настоящем исследовании позволило визуализировать отдельные скопления Cx43-содержащих структур, не различимых при световой микроскопии.

Проведённое нами иммуногистохимическое исследование впервые показало наличие белка щелевых контактов Cx43 в шишковидной железе человека. Более того, с помощью разработанного нами методического подхода удалось показать, что Cx43-содержащие структуры наблюдаются на мембранах астроцитов, и это позволяет предполагать наличие Cx43 в щелевых контактах данных клеток (вероятно, между соседними астроглиальными клетками). Рядом авторов предполагается, что межклеточная коммуникация, опосредованная щелевыми контактами, является важной детерминантой для синхронизации входных (поступление сигнала о наличии/отсутствии света) и выходных сигналов (секреция мелатонина) и таким образом служит ключевым компонентом в регуляции циркадной ритмичности [19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Локализация коннексина 43 не во всех, а лишь в некоторых астроцитах шишковидной железы человека свидетельствует о том, что щелевые контакты в астроглиальных клетках эпифиза мозга человека могут быть образованы не только коннексином 43, но и другими типами коннексинов. Альтернативным предположением может быть связь небольшого числа щелевых контактов со сравнительно низким уровнем коммуникации между астроцитами шишковидной железы, что нехарактерно для астроцитов других структур головного мозга.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 22-25-20051 (https://rscf.ru/project/22-25-20051/) и гранта Санкт-Петербургского научного фонда в соответствии с соглашением от 14.04.2022 г. № 47/2022.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Д.А. Суфиева — планирование эксперимента, сбор и обработка данных, фотографирование, приготовление иллюстраций, написание статьи; Е.А. Федорова — сбор и обработка данных, фотографирование; В.С. Яковлев — сбор и обработка данных; И.П. Григорьев — идея работы и планирование эксперимента, редактирование рукописи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The study was supported by the grant from the Russian Science Foundation, project N 22-25-20051 (https://rscf.ru/project/22-25-20051/) and the St. Petersburg Science Foundation in accordance with an agreement dated April 14, 2022, N 47/2022.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. D.A. Sufieva — experiment planning, data collection and processing, photographing, preparing illustrations, article writing; E.A. Fedorova — photographing, data collection and processing; V.S. Yakovlev — data collection and processing; I.P. Grigor'ev — study design, experiment planning, manuscript editing.

About the authors

Dina A. Sufieva

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: dinobrione@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0048-2981
SPIN-code: 3034-3137

Cand Sci (Biol.)

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena A. Fedorova

Institute of Experimental Medicine

Email: el-fedorova2014@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0190-885X
SPIN-code: 5414-4122

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladislav S. Yakovlev

Institute of Experimental Medicine

Email: 1547053@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2136-6717
SPIN-code: 7524-9870
Russian Federation, Saint Petersburg

Igor P. Grigor’ev

Institute of Experimental Medicine

Email: ipg-iem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3535-7638
SPIN-code: 1306-4860

Cand Sci (Biol.)

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files