Morphometrical features of proliferation and apoptosis of keratinocytes after administration of ascorbic acid in the model of radiation-induced skin damage

Full Text

Воздействие ионизирующего излучения в рамках терапии злокачественных новообразований (ЗНО) в некоторых случаях приводит к радиационно-индуцированному повреждению соседних органов [1]. В соответствии с законом Бергонье-Трибондо особенно радиочувствительными являются быстро регенерирующие ткани, обладающие высокой степенью пролиферативной активности. Это связано со стремительным накоплением нерепарируемых постлучевых мутаций в генетическом материале клеток в результате активации прямых и косвенных механизмов лучевого повреждения [2].

Некоторыми авторами показано появление морфологических признаков радиационно-индуцированного повреждения и фиброза в коже облученных животных [3]. Тем не менее, при сравнении с другими видами ионизирующего излучения в низких дозах, развитие аналогичных изменений регистрировалось при использовании электронов в дозах 40 Гр и более [4]. Так, было сделано предположение о меньшей степени лучевых повреждений при электронотерапии при сохранении эффективности этого вида облучения в отношении ЗНО.

Помимо характеристики лучевого повреждения электронами эпидермиса и дермы, практикоориентированным представляется исследование субстратов, обладающих радиопротекторными и регенеративными свойствами. В некоторых исследованиях показана эффективность препаратов из группы антиоксидантов, которые, вероятно, способны к связыванию свободных радикалов, блокируя развитие оксидативного стресса и индуцируя синтез ферментов антиоксидантной защиты (SOD, каталаза, пероксидаза и др.), однако их применение в онкологии до сих пор остается дискутабельным [5]. Наиболее известной в этой группе является аскорбиновая кислота (витамин С), чья протекторная эффективность уже доказана во многих органах при лучевом воздействии [6 – 8]. Тем не менее, на сегодняшний день отсутствует описание антиоксидантных свойств этого субстрата при воздействии ионизирующего излучения, а единственный одобренный радиопротекторный препарат амифостин обладает рядом недостатков (высокая стоимость, сложности применения, симптомы интоксикации и др.) [9], что особенно обусловливает актуальность и новизну исследований, посвященных поиску и апробации новых методов защиты здоровых кератиноцитов от лучевого воздействия.

Так, в недавнем исследовании было показано, что аскорбиновая кислота может приводить не только к снижению степени оксидативного стресса в коже, облученной ультрафиолетовыми лучами, но и снижать гибель кератиноцитов, оцененную по количеству окрашенных клеток при Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) и γ-H2A.X фокусов (маркер разрывов цепей ДНК) [10]. Более того, по результатам этого исследования была показана более высокая эффективность аскорбиновой кислоты при предлучевом введении по сравнению с постлучевым. Тем не менее, подобные работы остаются единичными, а влияние этого вещества на гибель кератиноцитов в ответ на воздействие электронами еще предстоит оценить. Кроме того, наиболее популярные иммуногистохимические методы предоставляют авторам лишь качественные или полуколичественные данные [11], что требует проведения морфометрической оценки обсуждаемых структурных изменений в эпидермисе при воздействии электронами и введении аскорбиновой кислоты.

 

ЦЕЛЬ

Морфологическая характеристика и иммуногистохимический анализ пролиферации и апоптоза в эпидермисе и дерме при локальном воздействии электронами, исследование радиопротекторных свойств аскорбиновой кислоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

 

 

 

 

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое проспективное контролируемое исследование. Объект исследования – фрагменты кожи наружной поверхности бедра крыс породы Вистар. Проведена оценка качественных (наличие/отсутствие морфологических изменений) и количественных (морфометрический анализ) характеристик.  Затем, фрагменты кожи подготавливали для гистологического исследования по стандартной методике.

Экспериментальные животные (n=50) были поделены на группы: I – контрольная (n=20), которым вводили физиологический раствор; II – локальное облучение электронами в разовой очаговой дозе (РОД) 40 Гр (n=10); III – введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг/кг перед облучением электронами в РОД 40 Гр (n=10); IV – введение аскорбиновой кислоты в дозе 50 мг/кг (n=10).

 

 

 

 

 

 

 

 

Критерии соответствия

В исследование были включены крысы породы Вистар (Rattus Wistar; n=50) массой тела 220 ± 20 (среднее значение ± стандартноеотклонение) грамм и возрастом 8 – 9 недель.

Условия проведения

Исследование проводилось на базе Радиологического отделения экспериментального корпуса МРНЦ имени А.Ф. Цыба (г. Обнинск, Россия).

Продолжительность исследования

Животных выводили из эксперимента на 10-е сутки после облучения электронами путем введения высоких доз комбинации анестетиков (кетамин+ксилазин, 50 мг/кг в/м + 5 мг/кг в/б).

Описание медицинского вмешательства

Облучение животных II и III групп проводили в области наружной поверхности бедра. Облучение электронами осуществляли с применением линейного акселератора «NOVAC-11» (Италия) со следующими установленными параметрами: частота 9 Гц, энергия 10 МэВ, мощность дозы 1 Гр/мин, размер поля – Ø 50 мм.

 

 

 

 

 

 

Методы регистрации исходов

Проводили макроскопическую оценку недепилированной кожи по шкале RTOG acute radiation morbiditv scoring criteria [12].

Степень оксидативного стресса и активность антиоксидантной системы оценивали иммуноферментным методом по уровням малонового диальдегида (продукта перекисного окисления липидов) и супероксиддисмутазы (фермент эндогенной редокс-системы) в 10% гомогенате, с использованием коммерческих наборов ELISA-kit в соответствии с инструкцией производителя (Lifespan Biosciences, USA).

Морфологическое исследование. Фрагменты кожи фиксировали в растворе забуферного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы (толщиной 3 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Для морфометрического анализа использовали компьютерную программу ImageJ, с помощью которой в коже оценивали толщину эпидермиса, дермы и гиподермы, внутренний диаметр и количество волосяных фолликулов.

Иммуногистохимическое исследование. Для иммуногистохимической (ИГХ) оценки пролиферации и апоптоза кератиноцитов использовали первичные антитела к Ki-67 (ThermoFisher, Clone MM1) и Caspase 3 (ThermoFisher, Clone 74T2), а также универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США) в качестве вторичных, с докрашиванием ядер кератиноцитов гематоксилином Майера. Подсчет ИГХ-позитивных клеток осуществляли в 10 рандомных полях зрения светового микроскопа при увеличении ´400.

Микроскопический анализ при гистологическом, морфометрическом и иммуногистохимическом исследованиях выполняли с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD).

Этическая экспертиза

Все болезненные процедуры на животных проводили в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 2006) и Хельсинской декларации (1964). Проведение исследования одобрено Локальным этическим комитетом МРНЦ имени А.Ф. Цыба (протокол № 6 от 04.06.20).

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки: размер выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных. Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows (IBM Analytics, США). Для оценки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. При нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента. При сравнении исследуемых групп при распределении, отличном от нормального, применяли критерий Краскела-Уоллиса с апостериорным критерием Данна, а данные выражали в виде: среднее значение ± стандартноеотклонение (SD). Парные сравнения между группами проводили при помощи U-теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Значение p≤0,05 считали статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты исследования

Фрагменты кожи наружной поверхности бедра крыс породы Вистар.

Основные результаты исследования

В группах контроля и введения аскорбиновой кислоты наблюдали гладкую кожу без изменений, с физиологической белесоватой окраской и коротким волосяным покровом (0 баллов по шкале RTOG). На 10-е сутки после локального облучения электронами обнаружили гиперемию кожи с развитием признаков лучевого дерматита умеренной степени (фокальное влажное шелушение, отек) и снижением плотности волосяного покрова (2 балла по шкале RTOG). В то же время, введение аскорбиновой кислоты перед облучением привело к развитию сухого шелушения с нормальным волосяным покровом и образованием фокусов, состоящих из эпидермальных пластинок белого цвета (1 балл по шкале RTOG).

Иммуноферментный анализ

Исследование уровней маркеров оксидативного стресса (малоновый диальдегид, MDA) и антиоксидантной системы (супероксиддисмутаза, SOD) демонстрировало резкое увеличение первого (в 3,0 раза; р=0,008) и снижение второго (в 1,3 раза; р=0,006) после локального воздействия электронами по сравнению с контрольными значениями. В то же время, предлучевое введение аскорбиновой кислоты способствовало частичному сохранению баланса оксидантов-антиоксидантов (табл. 1).

Гистологическое и морфометрическое исследование

Кожа контрольной группы (I-ая группа) и при введении аскорбиновой кислоты (IV-ая группа) состояла из эпидермиса, сосочкового и сетчатого слоев дермы и гиподермы с придатками и большим количеством волосяных фолликулов (рис. 1А). Облучение электронами (II-ая группа) привело к уплощению базального слоя эпидермиса и его частичной десквамации. Сосочковый слой дермы сглажен, а в просвете гемокапилляров отмечали сладж эритроцитов и расширение просвета. В эпидермально-дермальном соединении обнаружили микрополости, заполненные эпидермоцитами и полиморфно-ядерными лейкоцитами. Сальные железы отсутствовали, а волосяные фолликулы и гиподермис оставались практически интактными (рис. 1В). В группе предлучевого введения аскорбиновой кислоты обнаружили лишь частичное утолщение базального слоя эпидермиса в области волосяных каналов. Кроме того, в сосочковом слое дермы отмечали единичные полиморфно-ядерные лейкоциты и слабый отек. Придатки кожи визуально не изменены (рис. 1С).

При морфометрическом анализе облученной кожи выявили резкое снижение толщины эпидермиса (в 5,5 раза; р=0,034), дермы (в 1,7 раза; р=0,021) и гиподермы (в 4,5 раза; р=0,025), а также внутреннего диаметра (в 3,8 раза; р=0,028) и количества (в 1,3 раза; р=0,009) волосяных фолликулов по сравнению с контрольными значениями (табл. 2). В то же время, значения изучаемых параметров в группе предлучевого введения аскорбиновой кислоты были приближены к контрольным показателям. Толщина эпидермиса (в 4,4 раза; р=0,012), дермы (в 1,3 раза; р=0,018) и гиподермы (в 1,4 раза; р=0,04), а также диаметр (в 1,5 раза; р=0,009) и количество (в 1,2 раза; р=0,004) волосяных фолликулов были выше по сравнению со значениями II-ой группы (табл. 2).

Иммуногистохимическое исследование

Для ИГХ-оценки клеточного цикла кератиноцитов оценивали уровни фактора пролиферации – Ki-67 и фактора терминации апоптоза – каспазы-3. После воздействия электронами отмечали резкое снижение количества Ki-67-окрашенных клеток (в 2,6 раза; р=0,03) и увеличение числа каспаза-3-позитивных клеток с слабой цитоплазматической реакцией (в 6,6 раза; р=0,024), преимущественно в эпидермисе, по сравнению с контрольной группой (рис. 2). В то же время, предлучевое введение аскорбиновой кислоты частично обеспечивало протекцию соотношения пролиферации и апоптоза: повышение уровня экспрессии Ki-67 (в 2,0 раза; р=0,016) и снижение количества каспаза-3-позитивных клеток (в 1,6 раза; р=0,036) по сравнению с группой, облученной электронами (табл. 3, рис. 2).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

 

Резюме основного результата исследования

В коже экспериментальных животных воздействие электронами в дозе 40 Гр привело к нарушению ее гистоархитектоники с признаками радиационно-индуцированного повреждения кожи (шелушение, отек, гибель кератиноцитов, полиморфно-ядерная лейкоцитарная инфильтрация и др.). Данные морфологические изменения были менее выраженными в группе животных, которым перед облучением вводили аскорбиновую кислоту в дозе 50 мг/кг с радиопротекторной целью.

Обсуждение основного результата исследования

Цитотоксические эффекты ионизирующего излучения были доказаны во многих исследованиях [13]. Их развитие связано со стандартными механизмами лучевого повреждения в большинстве органов – прямыми и косвенными. Прямое действие происходит при непосредственном нарушении структуры макромолекул (в т. ч. ДНК) и индукции клеточной гибели путем апоптоза [14]. Косвенный путь представляет собой развитие оксидативного стресса с высвобождением свободных радикалов, продуктов радиолиза внутриклеточной воды, пероксидации липидных молекул [15]. В совокупности, это приводит к повреждению как цитоплазматической мембраны клеток, так и мембран внутриклеточных органелл (в т. ч. митохондрий), что влечет за собой активацию каскадов митохондриально-опосредованного некроза и апоптоза [16]. В коже это проявляется развитием радиацонно-индуцированного дерматита на ранних сроках [17].

Тем не менее, несмотря на схожесть путей лучевого повреждения, его выраженность значительно варьирует в зависимости от степени радиорезистентности ткани, сроков и скорости воздействия, дозы, вида облучения. Так, некоторыми авторами было показано, что воздействие Х-излучения уже в дозе 30 – 40 Гр приводит к выраженному влажному шелушению кожи, а доза более 40 Гр влечет за собой развитие множественных изъязвлений [18]. Другое исследование продемонстрировало, что g-излучение, обладая более высокой проникающей способностью, приводит к нарушению всех слоев кожи с поражением структуры кровеносных сосудов и гиподермиса, многочисленным эрозиям и язвам, а также выраженному воспалению при воздействии даже в небольших дозах [19]. Некоторые авторы проводили сравнение между двумя наиболее популярными видами ионизирующего излучения, придя к выводу, что ¹⁶⁶Ho g-излучение является более опасным в остром периоде по сравнению с гамма-лучами, однако в первом случае происходит репарация дефекта в отдаленные сроки [20]. Можно говорить о высокой токсичности большинства изученных на сегодняшний день видов облучения.

Тем не менее, перспективным представляется применение в радиотерапии облучения электронами, которые обладают более низкой массой. Этот факт может послужить объяснением более «щадящего» воздействия этого вида ионизирующего излучения в здоровой коже, обнаруженного в нашем исследовании даже при воздействии в дозе 40 Гр. Следует отметить, что эффективность такого облучения в отношении атипичных клеток не уступает таковой при других видах радиотерапии [21]. Таким образом, гибель кератиноцитов путем апоптоза, обнаруженная нами по уровням экспрессии каспазы-3 при ИГХ-исследовании, может быть связана с менее выраженной активацией прямого и косвенного путей лучевого повреждения [18].

Учитывая выраженность токсического действия оксидативного стресса при воздействии облучения электронами, интересным представляется проведение апробации субстратов, обладающих антиоксидантной активностью, одним из которых является аскорбиновая кислота [22]. Ее предлучевое введение в целях протекции можно считать оправданным в связи с полученными в настоящем исследовании данными о менее выраженных деструктивных изменениях эпидермиса и дермы, а также более высокой степени пролиферативной активности при низких значениях каспазы-3. Кроме того, наблюдаемое нами снижение концентрации MDA при сохранении высоких уровней SOD после введения аскорбиновой кислоты может свидетельствовать об ограничении косвенного пути лучевого повреждения путем снижения степени оксидативного стресса и синтеза прооксидантных молекул [7]. В дополнение к этому некоторые авторы заявляют о протективных свойствах этого антиоксиданта в отношении молекулы ДНК посредством связывания ионов Cu²⁺[23].

Ограничения исследования

Можно полагать, что выявленные морфологические изменения в структурах кожи при воздействии электронами являются менее выраженными по сравнению с эффектами других видов ионизирующего излучения, а предлучевое введение аскорбиновой кислоты потенциально может использоваться в качестве схемы радиопротекции кожи при лечении злокачественных новообразований ввиду как прямого антиоксидантного действия, так и косвенных эффектов: антиапоптотического и противовоспалительного свойств, а также стимуляции репаративной активности. Тем не менее, эти гипотезы требуют проведения более детальных исследований, однако частично согласуются с результатами, полученными другими авторами [18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведенного исследования можно говорить о высокой радиопротективной эффективности аскорбиновой кислоты в отношении эпидермиса и дермы при локальном воздействии электронов в дозе 40 Гр. Данные свойства этого антиоксиданта проявляются в предотвращении радиационно-индуцированной гибели кератиноцитов путем апоптоза, снижении степени оксидантного повреждения свободнокислыми радикалами, а также индукции ферментов эндогенной антиоксидантной защиты.

About the authors

Grigory Aleksandrovich Demyashkin

Federal State Budgetary Institution “National Medical Research Center of Radiology”; Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M.Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: dr.dga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8447-2600

Doctor of Medical Sciences, Head of the Department of Pathomorphology, Medical Radiological Research Center named after A.F. Tsyba – branch of the Federal State Budgetary Institution “National Medical Research Center of Radiology”, Head of the laboratory of histology and immunohistochemistry of the Institute of Translational Medicine and Biotechnology of the FSAEI HE I.M.Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Russian Federation, st. Koroleva, 4, Obninsk, 249036; Trubetskaya st., 8/2, Moscow, 119048

Matvey Vadyukhin

Institute of Clinical Medicine, Sechenov University

Email: vma20@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6235-1020

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

Anna Marukyan

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: Marukyan87@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4619-7385

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

Susanna Saakyan

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: drsaakyan@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-8606-8716

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

Elza Karakaeva

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: kchr09@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9833-3433

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

Alexey Kantorovich

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: w.q.989@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-9370-3600

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

Anastasiia Andrievskikh

First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov (Sechenov University)

Email: Andrievskikh2002@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-1787-5910

post-graduate student

Russian Federation, 119991, Russia, Moscow, Trubetskaya st., 8

References

Supplementary files