Histogenetic features of the formation of anorectal lining in rats in embryogenesis

Full Text

Обоснование

Познание гистологических основ формирования межтканевых взаимодействий в эмбриональном развитии позвоночных и человека является актуальной проблемой современной гистологии и эмбриологии. В некоторых участках организма животных и человека в ходе эмбрионального развития наблюдается пространственная смена клеточных и тканевых структур. В основе формирования аноректального канала у млекопитающих и человека в период эмбрионального развития лежат закономерные процессы взаимодействия генетически разных типов эпителиев – эпидермального и энтеродермального. Однако, в литературе существуют противоречия в трактовке механизмов взаимодействия эпителиальных пластов в области анального канала [1‒3].

Анализ эмбрионального развития аноректального канала позволил исследователям выделить три зоны эпителиальной выстилки [4–7]. Типичный многослойный эпителий кожного гистогенетического типа (но без волосяных фолликулов) представляет первую зону. Вторая (переходная) выстлана двуслойным эпителием, сходным по морфометрическим параметрам клеток с клетками эпителия мочеполового пространства. Третья зона представлена однослойным столбчатым эпителием кишечного гистогенетического типа, включающим разные клеточные диффероны [5]. Некоторые авторы называют формирующееся в ходе эмбрионального развития соединение производных энто- и эктодермы Z-зоной [8]. В данном отделе слизистая оболочка кишечника с криптами переходит в многослойный плоский эпителий слизистой оболочки анального канала. Разработанные Н.Г. Хлопиным и его школой положения учения о дивергентной эволюции тканей и изучения эпителиальных тканей, а именно анализ смежных участков эпителиев различного строения в пищеварительном тракте, позволяют с гистогенетических позиций осветить вопросы взаимоотношения тканевых элементов в смежных участках [9]. Структура эпителиальной выстилки аноректального канала взрослых млекопитающих выяснена достаточно полно, но сведений о ее формировании в эмбриогенезе пока недостаточно.

Цель

представить гистогенетические особенности формирования аноректальной выстилки у крыс в эмбриогенезе.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Проведено обсервационное одноцентровое ретроспективное неконтролируемое исследование. Материалом для исследования служил аноректальный канал 9-суточных (n=10), 13-суточных (n=10), 15-суточных (n=10) и 18-суточных зародышей крысы (n=10). Эмбриональный материал получен от половозрелых лабораторных белых крыс-самок (Rattus norvegicus, n=40) в условиях сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны Российской Федерации (Соглашение о научном сотрудничестве № 15 от 13.09.2023 г.). Материал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина в течение 24 ч, затем промывали в проточной воде, обезвоживали в нескольких порциях дегидратирующего раствора Изопрепа (БиоВитрум, Россия), заливали в парафиновые блоки. С помощью ротационного микротома Sakura Accu-Cut SRM 200 (Sakura Finetec, Япония) изготавливали серийные срезы (толщина 5 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в монтирующую среду Витрогель (БиоВитрум, Россия).

Критерии соответствия

В исследовании использовали животных без видимых аномалий.

Условия проведения

Исследование проводилось на кафедре гистологии с курсом эмбриологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (Санкт-Петербург, Россия) и на базе сертифицированного вивария Государственного научно-исследовательского испытательного института военной медицины Министерства обороны Российской Федерации (Санкт-Петербург, Россия).

Продолжительность исследования

Исследование выполнялось в течение 1 года (ноябрь 2023 г. – ноябрь 2024 г.).

Описание медицинского вмешательства

Зародыши были получены от первой беременности интактных самок крыс (Rattus norvegicus), наступление которой определяли по наличию сперматозоидов в вагинальных мазках. У беременных самок крыс под наркозом (внутримышечное введение смеси золетила 50 (Virbac, Франция) и ксилазина гидрохлорида (Pharmamagist Ltd., Венгрия), каждого вещества по 10 мг/кг массы животного) извлекали зародыши из рогов матки.

Анализ в группах

Анализировались гистологические препараты, которые были разделены на четыре группы: зародыши крыс 9-, 13-, 15- и 18-суток развития.

Методы регистрации исходов

Гистологические препараты анализировали с помощью микроскопа Zeiss Axio Scope.A1 (Carl Zeiss, Германия) с фотокамерой. Фотографирование препаратов и анализ материала осуществляли с помощью программы ZEN 2.3 (Zeiss Efficient Navigation, Германия). Проводили измерения разных частей аноректального канала в трех полях зрения микроскопа на каждом срезе.

Этическая экспертиза

Проведение исследования одобрено независимым этическим комитетом при Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (протокол № 283 от 17.10.2023 г.). Исследования проводили с соблюдением закона «О защите животных от жестокого обращения» (глава V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г.)

Статистический анализ

Статистическая обработка данных не проводилась.

Результаты

Объекты исследования

В работе использованы 150 гистологических препаратов 9-суточных, 13-суточных, 15-суточных и 18-суточных зародышей крыс.

Основные результаты исследования

На гистологических препаратах 9-суточного зародыша крысы в хвостовой части туловища хорошо различимы закладки каудальной части позвоночного столба, печени, задней кишки, каудальной части нервной трубки, а также клоакальная перепонка. Покров эмбриона представлен поверхностным слоем клеток с плоскими ядрами – перидермой. В области формирования клоакальной перепонки наблюдается изменение строения формирующегося наружного покрова, что проявляется в характере расположения клеток и морфометрических параметрах базальных клеток и клеток перидермы. Под перидермой располагается один слой клеток ‒ производных эктодермы, расположенный на базальной мембране. Такая структура свидетельствует о начале провизорной дифференцировки кожной эктодермы и формирования эпителиального покрова зародыша. Толщина эпителиального покрова вблизи клоакальной перепонки колеблется в широких пределах – от 53,30 до 109,52 мкм. Клетки базального слоя разнообразны по своим размерам и форме ядра. Здесь обнаруживаются округлые и овоидные ядра с гипохромной, нормохромной и гиперхромной окраской. Хроматин в виде сетевидно-нитчатых структур заполняет весь объем ядра, четко выявляются ядрышки. Базальные клетки не имеют четкой ориентации относительно базальной мембраны. Под базальной мембраной располагаются мезенхимоциты – компактно на границе с эпителием и более рыхло на удалении от него. В глубоких слоях дермы наблюдаются многочисленные кровеносные сосуды.

В области формирующейся клоакальной перепонки возникает инвагинация участка покрова. Клетки перидермы в дорсальном направлении приобретают гиперхромную окраску. В дорсальной части перепонки формируется клиновидный тяж клеток толщиной 48,72±2,31 мкм, подстилающий клоакальную перепонку. Тяж состоит из плотно прилежащих друг к другу овоидных и шаровидных клеток со светлыми ядрами и базофильной цитоплазмой. На протяжении клиновидного тяжа клеток в глубине мезенхимной клеточной массы обнаруживаются многочисленные кровеносные сосуды разного диаметра. К ним прилежат мезенхимоциты, расположенные рыхло, разнообразные по форме и размерам. По характеру строения клеточной массы и топографии кровеносных сосудов данное образование следует отнести к аллантоису, который вместе с желточным мешком в эмбриогенезе позвоночных является местом формирования первых кровеносных сосудов. В области будущей клоаки эту клеточную массу мы определяем как параклоакальную пластинку, возможно, являющуюся производной аллантоиса (рис. 1). У млекопитающих мочеполовой синус и аноректум (прямокишечная часть) являются производными клоаки, поэтому развитие аноректального канала тесно связано с развитием мочеполового синуса/клоаки (рис. 2). При анализе серийных срезов каудальной части 9-суточного зародыша крысы было выявлено углубление в мезенхиму клеток параклоакальной пластинки. Инвагинация клоакальной перепонки окружается клетками столбчатой формы. Находящиеся вокруг данной зоны мезенхимоциты приобретают упорядоченную, направленную вглубь, ориентацию. Обращает на себя внимание тот факт, что вектор роста клеток данной зоны (в краниальном направлении) ориентирован в глубину окружающей мезенхимы. Клетки, содержащие ядра столбчатой формы, остаются расположенными на периферии зоны роста клоакальной перепонки. Изменения гистологических элементов в области клоакальной перепонки свидетельствуют в пользу участия эпителия задней кишки и аллантоиса в виде параклоакальной пластинки в формировании клоакального пространства, локализованного в каудальной части зародыша.

У 9-суточных зародышей крысы в вентральной части клоакальной перепонки прослеживается изменение формы клоаки, которая приобретает форму пазухи (синуса). Это свидетельствует о преобразовании первичной клоаки в вентральной части в мочеполовое пространство, которое связано с протоком мезонефроса. Четко прослеживается многорядная двуслойная выстилка мочеполового пространства. Следует отметить, что гетероморфия гистологических элементов наиболее выражена в области контакта клоаки с поверхностью зародыша в области клоакальной перегородки. Наряду с клетками покрова формирующейся кожи в данном месте наблюдаются светлые клетки, характерные для ранее описанных столбчатых клеток кишечного эпителия, более темные клетки мочеполового пространства и гиперхромные клетки перидермы.

У зародышей крыс 13 суток развития аноректальный канал имеет вид трубки. По мере продвижения в краниальном направлении в нем выявляется контакт эпителия кожного типа (многослойного) с эпителием кишечного типа (однослойным), между которыми имеется небольшой участок двуслойного уротелиеподобного эпителия. У 15-суточных зародышей крыс кишечная часть аноректума имеет суженный участок диаметром 149,22±13,05 мкм, здесь в эпителии сформированы крипты глубиной 41,52±4,58 мкм. Эта часть затем переходит в расширенную часть кишки диаметром 189,84±16,78 мкм. Наиболее сложные в гистогенетическом плане процессы наблюдаются в области воронки, аноректального канала и непосредственного контакта эпителиев кожного и кишечного гистогенетических типов. У 15-суточных зародышей крыс обнаружено отсутствие уротелиеподобного эпителия, а в области контакта кожного и кишечного эпителиев регистрируется определенная реакция системы крови, которая выражается в появлении клеток гранулоцитарных (нейтрофильного и эозинофильного) клеточных дифферонов (рис. 3). Эпителий кожного типа в области границы с кишечным эпителием формирует булавовидные выпячивания, окруженные клетками фибробластического ряда, а также клеточными дифферонами крови. При этом эпителиоциты в составе выпячиваний гетероморфны, не имеют упорядоченной многослойной (характерной для кожного эпителия) структуры.

У зародышей крыс 18 суток развития продолжаются гистогенетические перестройки тканевых структур. Отчетливо идентифицируется зональность в строении аноректального канала. Преанальная кожа переходит в воронкообразное углубление с небольшими сальными железами и волосяными фолликулами; визуализируется крупная сальная железа на границе анально-кожной линии. Стенка анального канала выстлана многослойным частично ороговевающим эпителием, не содержащим волосяных фолликулов; ампула прямой кишки выстлана эпителием кишечного типа. Особый интерес представляет характеристика зоны взаимодействия эпителия кожного типа и эпителия кишечного типа. В целом, эта зона представлена вполне сформированными гистологическими структурами, которые определяют между собой границу между однослойным и многослойным гистогенетически различными видами эпителиев, но между двумя видами эпителиев располагается небольшое скопление клеток округлой формы с гиперхромными ядрами (рис. 4). Кишечные эпителиоциты в области границы несколько деформированы, но на некотором удалении от нее восстанавливают свою столбчатую форму, формируют крипты, в которых в небольшом количестве находятся и бокаловидные экзокриноциты.

К концу эмбриогенеза аноректальный канал и гистологические структуры, входящие в состав стенки каудальной части пищеварительной трубки, вполне сформированы. Все оболочки хорошо идентифицируются.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Наиболее сложные тканевые преобразования при формировании аноректального канала в раннем и позднем эмбриогенезе крысы заключаются в формировании клоакальной мембраны, ее инвагинации в мезенхиму, формировании кожно-кишечной эпителиальной границы с вероятным участием клеток клоаки (мочеполовое пространство), которые в качестве провизорных элементов существуют в эмбриогенезе, временно располагаясь между двумя видами эпителиев – кожным и кишечным.

Обсуждение основного результата исследования

Наличие разных эпителиев в составе выстилки аноректального канала у взрослых млекопитающих отмечено во многих работах [5, 7, 9–11]. Однако в период эмбрионального развития у крыс мы выявили в эпителиоидной выстилке аноректального канала клетки, отличающиеся от эпителиоцитов кишечного и кожного генетических типов. Находятся эти клетки между однослойным столбчатым и многослойным плоским эпителиями. По нашему мнению, это следует расценивать как результат происходящих в заднем отделе пищеварительной трубки сложных гистогенетических процессов, связанных с развитием органов мочеполовой системы и формированием клоаки в филогенезе позвоночных и онтогенезе млекопитающих. На взаимное влияние гистогенетических и формообразовательных процессов указано во многих гистологических работах [2, 5, 6, 12, 13]. Провизорный характер уротелиеподобной выстилки в составе аноректального канала можно обосновать процессами гистогенетических рекапитуляций и феноменом провизорности. Согласно работам профессоров Г.С. Соловьева, В.Л. Янина и их учеников, длительность существования провизорного субстрата определяется внутриорганизменными функциональными потребностями и зависит от условий существования организма [14, 15].

Заключение

Полученные данные по анализу эпителиев в ходе эмбрионального развития свидетельствуют, что в эмбриогенезе крыс между кожной и кишечной частями аноректального канала присутствует уротелиеподобный эпителий переходной зоны, который имеет иные особенности строения. На поздних стадиях эмбриогенеза этот эпителий исчезает, что свидетельствует о его провизорной дифференцировке.

Рис. 1. Параклоакальная пластинка, шаровидные ядра клеток (1), расположенные под перидермой, кровеносные сосуды с форменными элементами крови (2). Зародыш крысы, 9 сут. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. 1000 (иммерсия).

Fig. 1. Paracloacal plate, spherical cell nucleus located under the periderm (1), blood vessels with shaped blood elements (2). Rat embryo, day 9. Staining: hematoxylin and eosin. ×1000 (immersion).

Рис. 2. Формирование мочеполового синуса/клоаки (1). Полость амниона (2). Зародыш крысы, 9 сут. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. 100.

Fig. 2. Formation of the genitourinary sinus/cloaca (1). Amnion cavity (2). Rat embryo, day 9. Staining: hematoxylin and eosin. ×100.

Рис. 3. Клетки лейкоцитарного дифферона в составе эпителиальной выстилки в области контакта двух эпителиев аноректального канала. Зародыш крысы, 15 сут. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. 400.

Fig 3. Leukocyte differon cells (arrows) in the composition epithelial lining in area of contact of two epithelial tissues of anorectal canal. Rat embryo, day 15. Staining: hematoxylin and eosin. ×400.

Рис. 4. Клеточное скопление на границе эпителиев кожного и кишечного типов в аноректальном канале. Зародыш крысы, 18 сут. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. 1000 (иммерсия).

Fig. 4. A cell cluster at the border of the epithelium of the cutaneous and intestinal types in the anorectal canal. Rat embryo, day 18. Staining: hematoxylin and eosin. х1000 (immersion).

 

 

About the authors

Anastasiya Komarova

Federal state budgetary military educational institution of higher education «Kirov Military medical academy» of the Ministry of defence of the Russian Federation, Saint-Petersburg, Russian Federation

Author for correspondence.
Email: tsirya7777777@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-2390-9927
SPIN-code: 6584-6771

старший преподаватель кафедры гистологии с курсом эмбриологии

Russian Federation, 6G Akademika Lebedeva Str., Saint-Petersburg, 194044, Russian Federation

Dina R. Slutskaya

Federal state budgetary military educational institution of higher education «Kirov Military medical academy» of the Ministry of defence of the Russian Federation, Saint-Petersburg, Russian Federation

Email: dina_hanieva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3910-2621
SPIN-code: 2546-9393

Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor of The Department of the Histology with the course of Embryology

Russian Federation, 6G Akademika Lebedeva Str., Saint-Petersburg, 194044, Russian Federation

References

Supplementary files