INTERDEPENDENT CHANGES OF THE AXON AND SCHWANN CELL IN THE PROCESS OF REACTIVE REMODELING OF A MYELINATED NERVE FIBER

Full Text

Как известно, паранодальные петли узлового перехвата (Ранвье) и насечки миелина (НМ) (Шмидта—Лантермана) миелинового нервного волокна являются спиральными каналами, которые содержат цитоплазму шванновской клетки (ШК) [20]. На срезах под электронным микроскопом они выглядят как островки цитоплазмы ШК между расслоенными пластинками миелина [23]. В области петель аксон и ШК связаны с помощью септированных контактов [16]. Реактивная перестройка узлового перехвата в виде расслоения компактной паранодальной миелиновой оболочки и потери контрастности границы ее конусов наблюдается при дистрофии нервов и невропатии [12], при радиоактивном облучении [15], при экспериментально вызванном аллергическом неврите [7], при воздействии различными протеолитическими ферментами [25] и т. д. Набухание НМ и расслоение компактной миелиновой оболочки наблюдается при аксонопатии и при ее химическом раздражении [21], длительном электрическом возбуждении [4], повреждении корешков спинномозговых нервов [17]. У трансгенных мышей замена протеолипидных комплексов на протеин Р0 увеличивает количество НМ [24]. Реактивные изменения аксонов миелиновых волокон в сердце проявляются их деформацией в виде варикозностей [19], например, при его ишемической болезни [2]. Механизм появления варикозностей во время механической травмы был исследован при действии Са2+, калпаина, полоксамера 188 и хелатов [13]. По мнению G. Malkinson и M. E. Spira [14], образование варикозностей связано с разбалансированием передвижения органелл с антероградным током аксоплазмы и интенсивностью их использования. Деформация аксона может закончиться валлеровской дегенерацией, что наблюдается при перерезке нерва [11], эндотоксическом поражении нервной системы у больных с циррозом печени [1], на ранних ста диях ремиттирующего рассеянного склероза [10] и в других случаях. Таким образом, различные компоненты миелинового нервного волокна реагируют на любые нарушения гомеостаза внешней среды, и их перестройка происходит на ранних стадиях многих заболеваний нервной системы [6]. Цель настоящего исследования — выявить единство всего комплекса реактивных неспецифических изменений и взаимосвязь механизма водообмена между аксоном и ШК миелинового нервного волокна. Материал и методы. Исследованы миелиновые нервные волокна седалищного нерва 44 лягушек Rana temporaria с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа БИОМЕД-3И ФК (Биомед, Россия), цифровой USBкамеры DSM-510 (Биомед, Россия) и компьютера. Одиночные нервные волокна выделяли в растворе Рингера путем осторожного расщепления и помещали в импровизированную микрокамеру, дно которой образовано предметным стеклом, стенки формировали волокнами стекловаты, а сверху камеру покрывали обычным покрывным стеклом. Протекание раствора Рингера осуществляли с помощью отрезков отсасывающей фильтровальной бумаги. Часть нервов до препарирования обрабатывали 0,4% раствором микробной проназы (Serva, США) в течение 40 мин при комнатной температуре. При этих параметрах проназа не вызывает видимых изменений ультраструктуры нейронов. Проведено 2 серии экспериментов. В 1-й серии исследовали изменения миелиновых волокон, перенесших механическую травму при расщеплении нерва. Волокна разделяли по степени их изменений на 3 группы. На полученных изображениях с помощью программы ImageJ измеряли диаметры волокна и аксона в области измененной НМ и вне ее зоны. Во 2-й серии экспериментов исследовали характер морфологических изменений аксона, НМ, узловых перехватов и перикариона ШК при воздействии гипотонической среды (33%, 25% раствор Рингера). Проводили компьютерное измерение диаметров аксона и всего волокна в области НМ до и после воздействия гипотоническим раствором. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии и компьютерного количественного анализа определяли плотность расположения структур цитоскелета аксона в зоне набухших НМ, узловых перехватов, перикарионов ШК и вне этих зон. Электронную микроскопию продольных срезов расщепленных нервов проводили общепринятым методом после фиксации материала в течение 1 ч 2,5% глутаральдегидом на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,4) и последующей дофиксации в течение 1 ч 1% охлаждённым раствором четырехокиси осмия. После контрастирования уранилацетатом материал заливали в смесь эпоксидных смол. Ультратонкие срезы изготавливали с помощью ультратома LKB-5 (LKB, Швеция), контрастировали цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 100B (Jeol, Япония). На оцифрованных электронно-микроскопических снимках при помощи оригинальной программы Slice наносили прямую линию. В окне программы автоматически вдоль этой линии отображался график оптической плотности. На графиках осуществлялось масштабирование по максимальной длине выбранных линий. Программа вычисляла и отображала на графиках с помощью специальных маркеров локальные максимумы оптической плотности. Нахождение локальных максимумов выполнялось с учетом задаваемых значений фонового порога оптической плотности и «ширины полосы», представляющей разность между значениями соседних локальных максимума и минимума. Плотность расположения максимумов вычислялась как количество локальных максимумов на единице длины линии, что соответствовало плотности расположения структур цитоскелета аксона вдоль наносимой линии. Результаты исследования. В 1-й серии опытов после механической травмы исследованы живые миелиновые волокна с разной степенью повреждения. Анализировали НМ, узловые перехваты, перикарионы ШК и аксоны. Все НМ оказались набухшими. Если в норме они представляли собой едва заметные косые щели (рис. 1, а), то при повреждении они либо расширялись, образуя комплексы пластинок миелина (см. рис. 1, б), либо образовывали вытянутые набухшие овоиды с расслоениями пластинок (см. рис. 1, в). С помощью электронного микроскопа в области неизмененных НМ хорошо видны островки ненабухшей цитоплазмы ШК (рис. 2, а) и множественные расслоившиеся пластинки набухших НМ (см. рис. 2, в, д). Повреждение НМ характеризуется значительным их набуханием, они удлиняются и расслаиваются ещё больше. Локальные сужения аксона в области НМ формируют его варикозную деформацию. Прежде всего, обращает на себя внимание, что набухшие НМ не выпячиваются наружу. Контур волокна не выбухает, а скорее вдавливается внутрь аксона. Для выяснения этого феномена были измерены наружные диаметры волокна и аксона в области измененной НМ и вне ее. Оказалось, что наружные диаметры волокна в области НМ и в стороне от нее одинаковы (11,2±0,4 и 11,1±0,3 мкм соответственно), т.е. аксоплазма не выдавливалась по бокам от НМ. В то же время, диаметр аксона в области НМ был меньше на 59 % (P<0,05), чем в соседней области (2,99±0,27 и 7,42±0,29 мкм соответственно). Создавалось впечатление, что при реактивной перестройке НМ их набухание происходит за счет сужения аксона. Оказалось, что одновременно с НМ реактивную перестройку испытывают и узловые перехваты (рис. 3). Вначале появляется едва заметное расслоение миелинового конуса узлового перехвата, и он перестает быть видимым (см. рис. 3, б). Затем резкие расщепления миелиновой оболочки появляются в области луковицеобразного расширения перехвата, а узловая щель становится шире (см. рис. 3, в). С помощью электронного микроскопа у неповреждённых перехватов прослеживаются ненабухшие петли паранодального канала (рис. 4, а) и слабое расслоение компактной миелиновой оболочки. При слабой травме волокнá паранодальная миелиновая оболочка несколько набухает (см. рис. 4, в), сдавливая аксон. Резкие изменения травмированного узлового перехвата проявляются отчетливо выраженным набуханием миелиновой оболочки, отщеплением пластинчатых комплексов миелина и сужением аксона. Набухание цитоплазматического паранодального канала, расширение области, занятой миелином, за счёт диаметра аксона полностью совпадают с изменениями, наблюдаемыми в области НМ. Создается впечатление, что их объединяет общее набухание цитоплазмы ШК, т.е. изменение последней лежит в основе общей реактивной перестройки всего нервного волокна. Проверить это можно путем наблюдений за поведением перикариона ШК. В нетравмированном миелиновом волокне перикарион ШК имеет вид узкой светлой полоски посередине межузлового сегмента (рис. 5, а), но у повреждённых волокон он набухает и, не нарушая наружного контура волокна, впячивается в аксон, уменьшая его диаметр (см. рис. 5, б). В значительно изменённом волокне аксон резко сужается в области набухших НМ и узловых перехватов. При этом на оптическом срезе видно, что цитоплазма ШК выпячивается с двух сторон от миелиновой оболочки (см. рис. 5, в). При электронной микроскопии также было видно, что цитоплазма ШК вместе с ядром вдавливается внутрь волокна за счёт сужения аксона (рис. 6, а). В случае значительной травмы волокнá набухающая цитоплазма ШК может выступать с двух сторон от миелиновой оболочки (см. рис. 6, в). Для того, чтобы полностью проследить обратимую динамику всего процесса, были поставлены опыты от начала до конца на одних и тех же волокнах. Так как можно было считать, что речь идет об осмотическом набухании НМ, то в качестве агента, альтерирующего волокна, был выбран гипотонический раствор Рингера. При этом все толстые миелиновые волокна вели себя одинаково. Прежде всего, они не набухали и не изменяли своего наружного контура (рис. 7, а). НМ начинали набухать и, отщепляя крупные ламеллярные комплексы, вдавливались в аксон (см. рис. 7, б). Затем при продолжении отщепления новых пластинок миелина насечки несколько удлинялись (см. рис. 7, в). Процесс набухания НМ и сужения аксона легкообратим (см. рис. 7, г). Измерения до и после опыта показывали, что под воздействием гипотонического раствора наружный диаметр волокна не менялся (соответственно 8,2±0,5 и 9, 0±0,5 мкм, P>0,05), тогда как диаметр аксона в зоне НМ в ходе опыта значимо уменьшался на 29% (4,0±0,4 и 2,77±0,28 мкм соответственно). Представляет интерес механизм реактивной перестройки. Можно предположить, что локальное уменьшение объёма аксоплазмы обусловлено локальной его дегидратацией. Ответ на этот вопрос можно получить с помощью количественного определения концентрации структур цитоскелета аксона в области набухших НМ, узловых перехватов и перикариона ШК Плотность расположения микрофиламентов и микротрубочек в аксоне вне НМ составляла 0,04 отн. ед. В области ненабухших НМ (см. рис. 2, б, г, е) плотность распределения этих структур цитоскелета оставалась также низкой (0,06 отн. ед.). Однако в суженной области аксона при набухании НМ реактивно изменённого волокна она возрастает на 200–275% (см. рис. 4, г, е). В аксоне неизмененного узлового перехвата плотность расположения структур цитоскелета (см. рис. 4, б) близка к таковой в зоне неизмененной НМ, но в области набухших перехватов их плотность расположения возрастает до 200–250% (см. рис. 4, г, е). Важно, что такая же высокая плотность расположения компонентов цитоскелета в аксоплазме появляется и в пределах набухающего перикариона ШК (см. рис. 6, б, г). Она увеличивается по сравнению с таковой в неизмененном волокне вне НМ и узловых перехватов, примерно, на 200–275%. У всех 36 реактивно-изменённых аксонов под электронным микроскопом в области набухших НМ, узловых перехватов и перикарионов ШК плотность расположения структур цитоскелета оказалась в среднем на 62% больше, чем вне изменённых перечисленных структур. Полученные данные свидетельствуют о том, что феномен реактивной перестройки миелинового нервного волокна связан не просто с перемещением вещества аксоплазмы, а обусловлен дегидратацией и транслокацией ее жидкой фракции в структуры, занятые цитоплазмой ШК. Обсуждение полученных данных. Таким образом, прижизненная микроскопия и электронно-микроскопическое определение плотности расположения структур цитоскелета аксоплазмы показывают, что реактивная перестройка миелинового волокна охватывает все его компоненты, при этом обнаруживается новый механизм глионейрональных взаимодействий, обусловленный, по-видимому, транслокацией жидкой фракции аксоплазмы из аксона в глиальную клетку. Как известно, существуют многочисленные взаимодействия между нейроном и глиоцитом. Были получены данные о том, что глиоциты участвуют в доставке к нему питательных веществ, а также лактата [18]. Исследования M. Takahashi и соавт. [22] показали, что в нормальных условиях глиоциты поглощают медиатор глутамат, выделяемый из нейронов. Описан ряд Ca2+-зависимых глиомедиаторов и нескольких нейротрофических факторов [5]. При помощи поглощения внеклеточного калия глиоциты способны модулировать активность нейронной сети [8]. Глиоциты нередко выполняют роль оболочек или сателлитов нейронов, и поэтому исследователей всегда интересовало взаимодействие этих клеток. Давно известно, что миелиновая оболочка появляется в волокнах, только достигших около 10 мкм в диаметре, и при сложной организации волокна требуется поддержка аксона. В последнее время становится всё яснее, что даже типичные демиелинизирующие заболевания начинаются с первичных морфологических и электрических изменений аксоплазмы [3]. Общепризнанными каналами связи между аксоплазмой и глиоцитом считаются уникальные цитоплазматические каналы НМ и паранодальных петель [20], которые способны пропускать и липиды, и белковые молекулы. Издавна влияние глии на нейрон рассматривалось как электроизолирующее, а взаимодействия глии и нейрона — как симбиотические [9]. Описанные нами реактивные изменения аксона за счёт набухания ШК, видимо, уже нельзя именовать симбиотическими, но они еще не имеют признаков необратимых повреждений аксонов [6]. Скорее всего, эта обратимая реактивная перестройка единого комплекса живого миелинового волокна. В проведённых нами прижизненных морфометрических исследованиях показан новый тип взаимодействия между аксоном и ШК, который заключается в обратно пропорциональном изменении их объемов, что, по-видимому, связано с обратимой транслокацией водной фракции аксоплазмы в цитоплазму глиоцита. Реактивная перестройка миелинового волокна состоит из набухания НМ, паранодальных петель узлового перехвата, перикариона ШК и сужения аксона. При действии механической травмы и даже гипотонического раствора на миелиновое волокно набухание НМ, узловых перехватов и перикарионов ШК неотъемлемо связано со значительным увеличением плотности расположения структур цитоскелета аксона в этих областях. Возможно, цитоскелет играет одну из главных ролей в массообмене между аксоном и ШК при набухании структур миелиновой оболочки. Реактивная обратимая перестройка миелинового волокна предполагает новый тип взаимодействия аксона и ШК, связанный с обратимой транслокацией жидкой фракции аксоплазмы в цитоплазму глиоцита.

About the authors

T. N. Kokurina

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: kokurina.tatyana@mail.ru

O. S. Sotnikov

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: sotnikov@kolt.infran.ru

S. A. Novakovskaya

Institute of Physiology

Email: novakovskaya@tut.by

A. S. Yegorov

Institute of Physiology

R. V. Kozhevetz

Institute of Physiology

S. D. Solnuschkin

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

V. N. Chikhman

RAS I. P. Pavlov Institute of Physiology

Email: chi@physiology.spb.ru

References

Supplementary files