ФОРМИРОВАНИЕ ГАМК-ергической НЕЙРАЛЬНОЙ СЕТИ В КОМПЛЕКСЕ БЕТЦИНГЕРА У КРЫС В РАННИЙ ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД В НОРМЕ И ПРИ ПРЕНАТАЛЬНОМ ДЕФИЦИТЕ ЭНДОГЕННОГО СЕРОТОНИНА

Полный текст

Регуляцию последовательной смены фаз респираторного цикла, как известно, в значительной мере осуществляют бульбоспинальные нейроны комплекса Бетцингера [5, 7]. У взрослых животных в его состав входят несколько популяций тормозных нейронов, включающих экспираторные, постинспираторные и усиливающие (augmenting) экспираторные нейроны [7-9], проецирующиеся на мотонейроны, иннервирующие респираторные мышцы верхних дыхательных путей [8], и мотонейроны, иннервирующие диафрагмальные и межреберные дыхательные мышцы, непосредственно участвующие в формировании глубины, частоты и ритма дыхания [18]. Показано, что важную роль в контроле респираторного цикла играет координированная взаимосвязь нейротрансмиттеров ЦНС, среди них основным является тормозный трансмиттер гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), а также серотонин, который, в свою очередь, модулирует тормозные эффекты ГАМК [4, 17, 21]. Установлено, что первые 2 нед постнатального периода являются самыми важными для развития и созревания дыхательной системы у млекопитающих животных и человека. В это время в респираторных ядрах продолговатого мозга имеет место экспрессия возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров, а также нейрохимических соединений, активность которых в ходе развития изменяется [20]. Физиологические эксперименты показали, что для поддержания нормального респираторного ритма у грызунов в ранний постнатальный период в комплексе Бетцингера необходим определенный уровень ГАМК, снижение которого вызывает нарушение респираторной функции и приводит к апноэ и брадипноэ [12]. Существенную роль в передаче импульсов, опосредованной ГАМК, обеспечивающей тормозные эффекты, играет рецепторное звено, представленное двумя классами рецепторов - ГАМК-Аи ГАМК-В, которые, как предполагают, активируются самой ГАМК [19]. В литературе практически отсутствуют данные о состоянии как тормозной ГАМК-ергической сети, так и об экспрессии разных типов рецепторов, осуществляющих связывание ГАМК в комплексе Бетцингера в ранний постнатальный период. Ритм, частота и глубина дыхания, как полагают, контролируются разными нейротрансмиттерами. В ранний постнатальный период в комплексе Бетцингера обнаруживаются рецепторы серотонина и терминали, содержащие серотонин [21]. Однако какова степень зависимости развивающейся ГАМК-ергической системы от уровня экспрессии основных нейротрансмиттеров, в частности, серотонина, неизвестно. В связи с этим цель данной работы - изучение динамики распределения ГАМК-ергических нейронов и нейронов, экспрессирующих разные типы рецепторов (ГАМК-А и ГАМК-В), в комплексе Бетцингера в ранний постнатальный период в норме и при пренатальном снижении содержания серотонина у крыс. Материал и методы. Работа проведена на крысах линии Вистар. Содержание животных и все экспериментальные процедуры осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Для снижения содержания эндогенного серотонина использовали метод ингибирования триптофан-гидроксилазы (фермента его синтеза) парахлорфенилаланином (пХФА) (Sigma, США). Самкам крыс вводили пХФА в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно на 9-е сутки беременности (для длительного снижения содержания эндогенного серотонина до 50-80% в период формирования у плодов собственной серотонинергической системы). Головной мозг у крысят исследовали на 5- (n=5), 9-е (n=4) и 20-е (n=4) сутки после рождения. В качестве контроля использовали животных (n=9) в соответствующие сроки развития, полученных от интактных самок. Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде на фосфатносолевом буфере (рH 7,4), заливали в парафин по общепринятой методике и готовили серийные поперечные срезы продолговатого мозга толщиной 5 мкм на уровне Bregma -12,00-12,48 мм [14]. Иммуноцитохимическую реакцию (ИЦР) выявления ГАМК-ергических нейронов проводили с использованием кроличьих поликлональных антител к GAD-67 (Spring Bioscience, США). В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (DakoCytomation, США). ИЦР, выявляющие нейроны, экспрессирующие ГАМК-А-и ГАМК-В-рецепторы, проводили с использованием кроличьих поликлональных антител к ГАМК-Aα1-и ГАМКВ-рецепторам соответственно (Abcam, США). В качестве вторичных реагентов для выявления ГАМК-Aα1-рецептора и ГАМК-B-рецептора применяли реактивы из набора LSAB2 System-HRP (Dako, Дания). Для выявления продукта реакции использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения ИЦР часть срезов докрашивали гематоксилином Майера (Bio-Optica, Италия) и заключали в синтетическую среду Permaunt (Termo, США). Условия проведения ИЦР были стандартизированы, все процедуры при этом у контрольных и подопытных животных осуществляли одновременно. Морфологический анализ и количественное исследование проводили на цифровых изображениях серийных срезов, полученных при помощи светового микроскопа Leica DME (Leica, Германия) и цифровой камеры Leica EC3 (Leica, Германия). Подсчет числа ГАМК-, ГАМК-Аα1-рецептор-и ГАМКВ1-рецептор-иммунопозитивных (ИП) нейронов проводили на 10 серийных срезах мозга, полученного от 3-4 животных в каждый срок исследования как контрольной, так и экспериментальной групп, на стандартной площади среза, равной 0,105 мм², при об. 40, ок. 10. Учитывали плотность сети ИП терминальных отростков в нейропиле и распределение гранул, которые принято считать синаптическими структурами, их скопления, а также терминальные варикозные расширения, свидетельствующие о незрелости терминальных отростков [10]. Статистическую обработку полученных морфометрических показателей осуществляли при помощи прикладных компьютерных программ Statistica 6.0, ImageScope Color и ORIGIN50. Значимость различий определяли по величине t-критерия Стьюдента. Различия считали значимыми при P<0,05. Результаты исследования. Распределение GAD-67-ИП-нейронов в комплексе Бетцингера. У контрольных крысят на 5-е сутки после рождения основная часть нейронов ядра - 12,8±1,3 (здесь и далее количество на стандартной площади среза) являются ИП. В нейропиле присутствует рыхлая сеть ИП-терминалей, мало гранул, на телах нейронов они единичны (рисунок, а). На 9-е сутки в ядре обнаружены 1,0±0,6 ИП-нейронов. В нейропиле - плотная сеть терминалей, много крупных гранул. На 20-е сутки картина аналогичная: в ядре 1,0±0,8 ИП-нейронов. В нейропиле - плотная сеть терминалей, много крупных гранул (см. рисунок, б). У животных с пренатальной недостаточностью серотонина на 5-е сутки после рождения в ядре на стандартной площади среза обнаруживаются 8,2±0,3 ИП-нейронов. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, крупные гранулы единичны. На 9-е сутки выявляются 2,0±0,4 ИП-нейронов. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, очень много крупных гранул как одиночных, так и их групп. На телах нейронов 3-9 гранул. На 20-е сутки в ядре - 2,0±0,6 ИП-нейронов. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, однако много крупных гранул (см. рисунок, в). Распределение ГAМК-Аα1-рецептор-ИПнейронов в комплексе Бетцингера. У контрольных животных на 5-е сутки в ядре присутствуют 10,5±0,3 нейронов (большинство на срезе), имеющих ГAМК-Аα1-ИП-рецепторы, цитоплазма нейронов и отростки ИП, в нейропиле терминали с крупными гранулами образуют рыхлую сеть. На телах нейронов - много мелких зерен и одиночных крупных гранул. На 9-е сутки в ядре число ИП-нейронов увеличивается и составляет 17,3±0,7. В нейропиле - плотная сеть терминалей, много крупных гранул. На телах нейронов гранул мало - 2-3. На 20-е сутки в ядре большинство ИП-нейронов сохраняются - 12,5±0,6. В нейропиле - плотная сеть терминалей, много крупных гранул, располагающихся группами и одиночно. На телах нейронов гранул мало - 3-5 (см. рисунок, д). У животных с пренатальной недостаточностью серотонина на 5-е сутки после рождения в ядре присутствуют 2,1±0,3 ИП-нейрона с небольшим объемом цитоплазмы. В нейропиле немногочисленные ИП-терминали образуют рыхлую сеть, крупных гранул очень мало. На телах нейронов гранул нет (см. рисунок, г). На 9-е сутки число ИП-нейронов увеличивается и составляет 9,4±0,3. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, крупных гранул мало. На телах нейронов их нет. На 20-е сутки в ядре выявляются 11,7±0,6 ИП-нейронов (бóльшая часть клеток на срезе). В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, мало гранул. На телах нейронов гранул практически нет (см. рисунок, е). Распределение ГAМК-В1-рецептор-ИПнейронов в комплексе Бетцингера. У животных в контроле на 5-е сутки после рождения в ядре присутствуют 14,3±0,5 ИП-нейронов, составляющих большую часть от общего числа клеток на срезе. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, мало крупных гранул. На телах нейронов - гранул нет. На 9-е сутки число ИП-нейронов не изменяется и составляет 14,1±0,3, при этом повышается интенсивность реакции цитоплазмы. В нейропиле - рыхлая сеть терминалей, мало гранул. На телах нейронов их 8-10. На 20-е сутки в ядре численность ИП-нейронов сохраняется, составляя 14,6±0,8 клеток с интенсивной реакцией цитоплазмы. В нейропиле - плотная сеть ИП-терминалей, много крупных гранул, расположенных группами. На телах нейронов гранул много - до 10. Распределение ГAМК-В1-рецептор-ИП-нейронов в комплексе Бетцингера. У животных с пренатальной недостаточностью серотонина на 5-е сутки после рождения большинство нейронов ядра (16,6±0,4) - ИП, реакция цитоплазмы слабая. В нейропиле ИП-терминали образуют рыхлую сеть, встречаются единичные гранулы. На 9-е сутки число ИП-нейронов с интенсивной реакцией цитоплазмы соответствует таковому в предыдущий срок исследования и составляет 15,3±0,7. В нейропиле определяются рыхлая сеть тонких терминалей и незначительное количество крупных гранул. На телах нейронов гранул нет. На 20-е сутки в ядре численность ИП-нейронов снижается до 7,6±0,8. В нейропиле сохраняются рыхлая сеть ИП-терминалей и малочисленность крупных гранул, располагающихся преимущественно одиночно. На телах нейронов гранул мало - от 2 до 4. Обсуждение полученных данных. Проведенное исследование показало, что в комплексе Бетцингера у крысят в 1-ю неделю после рождения довольно много GAD-67-ИП-нейронов, что свидетельствует о существенной экспрессии ГАМК на этом этапе развития. При этом в нейропиле выявляются малочисленные терминали и редкие синаптические структуры, содержащие ГАМК. Во время 2-й (к 9-м суткам) и к концу 3-й недели постнатальной жизни происходит резкое снижение числа GAD-67-ИП-нейронов, а в нейропиле к этому сроку формируется плотная сеть ИП-терминалей. Сходная динамика изменения экспрессии ГАМК в 1-е 3 нед после рождения была обнаружена во вкусовых субъядрах ростральной части ядра одиночного пути [11]. Предполагают, что высокий уровень экспрессии ГАМК нейронами и слабо развитые терминальная и синаптическая сети, содержащие ГАМК, в 1-ю неделю после рождения являются доказательством не трансмиттерной, а вероятно, нейротрофической функции ГАМК в этот период [11]. Результаты показали, что у животных, развивавшихся при низком содержании серотонина, в отличие от контрольных, в ранние сроки после рождения незначительная часть нейронов являются GAD-67-ИП. К концу 3-й недели, так же как в контроле, число GAD-67-ИП-нейронов снижается, но, в отличие от контроля, в нейропиле сохраняется рыхлая, слабо развитая терминальная ИП-сеть, при этом плотность распределения синаптических структур, содержащих ГАМК, увеличивается. Данных о влиянии серотонина на становление структурной организации комплекса Бетцингера в пренатальный период в литературе обнаружить не удалось. Однако есть основания предполагать, что недостаток серотонина в период развития может нарушать процесс миграции предшественников ГАМК-ергических нейронов, приводить к задержке экспрессии ГАМК и дифференцировки нейронов комплекса Бетцингера, так же как и нейронов других формаций мозга [1-3] и, соответственно, задержке формирования нейрональных отростков и терминалей. Считают, что созревание рецепторов ГАМК является ключевым моментом при переходе от нетрансмиттерных функций ГАМК к нейротрансмиттерным [11]. Результаты проведенного исследования показали, что в ранние постнатальные сроки (к 5-м суткам) в ядре уже присутствуют структуры, содержащие оба типа рецепторов, однако в динамике развития рецепторных систем ГАМК-Аα1 и ГАМК-В1 существуют различия. Во время первых 3 нед после рождения отмечено колебание интенсивности экспрессии ГАМК-Аα1-рецептора. Так, в течение 2-й недели (к 9-м суткам) число ГАМК-Аα1-рецептор-ИП-нейронов повышается в 1,6 раза, но затем к концу 3-й недели происходит его снижение и последующее возвращение к начальному значению. Вероятно, такое повышение экспрессии ГАМК-Аα1-рецептора во время 2-й недели можно объяснить интенсивно формирующейся в нейропиле плотной сети терминалей и синаптических структур, содержащих ГАМКАα1-рецептор. Наблюдения показали, что к 5-м суткам подавляющее число нейронов в ядре имеют ГАМКВ1-ИП-рецепторы, и их численность остается постоянной на протяжении 3 нед после рождения, однако сформированная плотная сеть терминалей и синапсов, содержащих ГАМК-В1-рецепторы, обнаруживается только к концу 3-й недели. Вероятно, у контрольных животных в комплексе Бетцингера созревание системы ГАМК-Аα1рецепторов происходит раньше, чем ГАМК-В1рецепторов. Исследование показало, что пренатальный дефицит серотонина оказывает влияние на становление рецепторов как ГАМК-Аα1, так и ГАМК-В1 в ранний постнатальный период. У животных, развивавшихся при дефиците серотонина, на 5-е сутки после рождения, в отличие от контроля, имеет место низкая экспрессия ГАМК-Аα1-рецептора, о чем свидетельствуют единичные ИП-нейроны, имеющие ГАМК-Аα1рецептор. К 9-м суткам их число увеличивается примерно в 5 раз, а к концу 3-й недели оно соответствует контрольному значению. В более ранние сроки в нейропиле не выявляются ГАМКАα1-рецептор-ИП-терминали, а синаптические структуры единичны. Во время 2-й и к концу 3-й недели в нейропиле сохраняется рыхлая сеть ИП-терминалей и количество синапсов. Исследование показало, что значительная часть нейронов ядра экспрессируют ГАМК-В1рецептор во время первых 2 нед после рождения, однако к концу 3-й недели их число снижается в 2 раза. В нейропиле на протяжении 3 нед выявляются рыхлая сеть тонких терминалей и по сравнению с контролем значительно меньшая плотность распределения синаптических структур, содержащих ГАМК-В1-рецептор. Таким образом, в заключение следует отметить, что созревание тормозной ГАМК-ергической сети в комплексе Бетцингера происходит в ранние постнатальные сроки развития (к 9-м суткам). В ядре одновременно с ГАМК осуществляется экспрессия ГАМК-Аα1-иГAМКВ1-рецепторов, однако в их созревании имеются различия. Созревание системы ГАМК-Аα1рецепторов происходит раньше и совпадает по времени (к 9-м суткам) с ГАМК, что подтверждает предположение о том, что в респираторных ядрах ГАМК-Аα1-рецептор является основным в связывании ГАМК [10, 11]. Созревание ГAМКВ1-рецепторов происходит позже - только к концу 3-й недели. Пренатальный дефицит серотонина оказывает влияние на состояние тормозной ГАМК-ергической системы в ранний постнатальный период: имеют место задержка экспрессии ГАМК и ГАМК-Аα1-рецепторов нейронами ядра, нарушение формирования сети терминалей и синапсов, содержащих ГАМК, ГАМК-Аα1-и ГАМК-В1-рецепторы. Итак, надо подчеркнуть, что нейроны комплекса Бетцингера имеют не только спинномозговые и медуллярные аксональные проекции, но и являются источником моносинаптического торможения как диафрагмальных мотонейронов, так и инспираторных нейронов вентролатеральной части ядра одиночного пути, а также нейронов позадидвойного ядра [6, 13, 15, 16]. Учитывая полученные данные, можно считать вероятным, что изменения в структуре тормозной системы комплекса Бетцингера в ранний постнатальный период, являющиеся следствием пренатального дефицита серотонина, могут приводить к нарушению респираторной функции, а также играть существенную роль в возникновении синдрома внезапной детской смерти.

Об авторах

Людмила Ивановна Хожай

Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН

Email: astarta0505@mail.ru
лаборатория онтогенеза нервной системы 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6

Надежда Викторовна Ильичева

Институт цитологии РАН

Email: nad9009@yandex.ru
группа некодирующей ДНК 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4

Список литературы

Дополнительные файлы