РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ НЕЙРОФИЛАМЕНТОВ В ПОЯСНОЙ КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ

Полный текст

Одной из структур головного мозга человека, изучение которой в последнее время вызывает пристальный интерес специалистов в области нейрокогнитивных исследований, является кора поясной извилины (цингулярная кора), расположенная на медиальной поверхности головного мозга между мозолистым телом и поясной бороздой [16]. Данная область мозга является составной частью лимбической системы и получает афферентные сигналы от передней группы ядер таламуса. Эфферентные сигналы из цингулярной коры идут в парагиппокампальную извилину и далее в гиппокамп. Кроме того, цингулярная кора имеет многочисленные двусторонние связи с лобной, теменной и затылочной корой полушарий большого мозга. В цитоархитектоническом отношении цингулярная кора довольно неоднородна. По классификации К. Бродмана [8], в ней различают семь полей. Но в связи с тем, что точные границы между полями практически невозможно визуально различить на томограммах, в последнее время в цингулярной коре выделяют только три крупных отдела: переднюю (поля 24 и 33), заднюю (поля 23 и 31) и ретросплениальную (поля 26, 29 и 30) кору. Иногда в задней цингулярной коре дополнительно выделяют вентральную (поле 23) и дорсальную (поле 31) части [2]. Поясная кора принимает участие в осуществлении важнейших реакций организма, включающих регуляцию вегетативных и эндокринных функций, локомоции, ноцицепции, обработку поступающей извне информации, оценку эмоций, а также - в реализации когнитивных функций, таких как ожидание награды, принятие решений, эмпатии. Вследствие этого она играет важнейшую роль в социальных взаимоотношениях и при психопатологических состояниях, в первую очередь, при депрессии и шизофрении [2, 9-10, 13]. Исследование структурных особенностей нейронов и их отростков в этой области мозга в норме является важной задачей для оценки влияния их изменения при патологии на когнитивные и психические нарушения функций мозга. Для оценки состояния нервных проводников существуют небольшое количество маркеров, оптимальные среди них - белки нейрофиламентов, присутствующие преимущественно в отростках нервных клеток. Нейрофиламенты (НФ) - один из видов промежуточных филаментов, внутриклеточных компонентов цитоскелета, специфичных для нейронов. Они необходимы для поддержания сложной формы нервной клетки и ее отростков и обеспечения медленного аксонального транспорта. Среди белков НФ выделяют три группы, различающиеся по молекулярной массе: низкомолекулярные с молекулярной массой 68-73 килодальтон, белки промежуточной массы - 140-160 и высокомолекулярные - 195-200 килодальтон [3]. Иммуногистохимическая реакция на НФ широко используется в нейрогистологических исследованиях [5, 11-12, 14-15]. Цель настоящего исследования - изучение особенностей распределения низкомолекулярных белков НФ в поясной коре и прилежащих к ней отделах переднего мозга крысы с использованием моноклональных антител, специфических для НФ с молекулярной массой 70 килодальтон, и оценка возможности использования этой методики для исследования особенностей организации миелоархитектоники в коре и других структурах мозга. Материал и методы. В работе использован головной мозг половозрелых (5-6 мес) крыс-самцов линии Вистар (7 особей). При содержании животных и выведении их из эксперимента руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.), Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г. План проведения работ утвержден и одобрен на заседании локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 2 от 13.11.2015 г.). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [4], обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Готовили срезы толщиной 5 мкм. После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере S1700 (Dako, Дания). Локализацию низкомолекулярных белков НФ определяли с помощью мышиных моноклональных антител к НФ человека (клон 2F11, разведение 1:300, номер по каталогу М 0762, Dako, Дания). Для выявления комплекса антиген-антитело для световой микроскопии применяли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой, из набора MACH2 Universal HRP polymer (Biocare Medical, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции при световой микроскопии использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения реакции часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином. Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750 (Leica, Германия), фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Препараты срезов мозга сканировали с помощью сканера Epson Perfection V500 Photo (Epson, Япония). Локализацию областей мозга определяли по стереотаксическому атласу [16]. Результаты исследования. Иммуноцитохимическое выявление низкомолекулярных белков НФ в поясной коре и прилежащих к ней отделах переднего мозга крысы показало её неравномерное распределение (рисунок, а). Очень высокая интенсивность окрашивания на НФ обнаруживается в поясной коре и белом веществе двигательной, соматосенсорной и инсулярной коры. В гиппокампе также наблюдается выраженная неоднородность окрашивания. Наибольшая интенсивность окраски на НФ наблюдалась в бахромке (фимбрии) гиппокампа, наименьшая - в медиальной части зоны СА1, в латеральной части зоны СА2 и stratum lucidum hippocampus. Лишь интенсивность окраски в фимбрии сопоставима с таковой в близлежащей поясной извилине, в остальных областях гиппокампа она значительно слабее. В большинстве зон коры большого мозга окраска слабая, а в инсулярной и пириформной коре практически отсутствует. В соматосенсорной коре можно заметить слабую или умеренную НФ-иммунореактивность, в частности в IV слое соматосенсорной коры. Наиболее интенсивная среди корковых областей НФ-иммунореактивность наблюдается в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре. НФ-иммунореактивность была чётко ограничена данной областью неокортекса, резко ослабевая в более латеральных зонах (см. рисунок, б). При этом экспрессия НФ в цингулярной и ретросплениальной коре имела чёткое послойное распределение в верхних слоях: интенсивная окраска в поверхностной части I слоя сменялась слабой иммуноокраской в подлежащей части слоя I, слой II прокрашивался интенсивно, а слой III - слабо. Более глубокие слои имели относительно гомогенное и достаточно сильное окрашивание, хотя и слабее по сравнению с ярко окрашенными полосами в слоях I и II. При большем увеличении в ретросплениальной коре выявлялось большое число волокон, иммунопозитивных к белкам НФ. НФ-иммунопозитивных клеточных тел не наблюдалось. В области поясной коры волокна шли ростро-каудально, а в прилегающих зонах - расходились радиально. Отростки клеток радиально пересекали все слои коры (см. рисунок, в). В слое I коры около поверхности радиальные отростки имели большую степень ветвления и были разнонаправлены. В мозолистом теле под цингулярной корой выявлялись два слоя НФ-иммунопозитивных структур: тонкий дорсальный слой с очень интенсивной окраской и слабо окрашенный вентральный слой. Также очень интенсивной окраской отличалась область пояса, подлежащая под цингулярной корой. Обсуждение полученных дан ных. Низкомолекулярные белки НФ, выявляемые с помощью иммуногистохимии (антитела клона 2F11), экспрессируются в головном мозгу крысы с выраженной неравномерностью. Наиболее интенсивно окрашиваются на НФ проводящие пути: пояс, узкая дорсальная полоска мозолистого тела, белое вещество двигательной, соматосенсорной и инсулярной коры и stratum lucidum hippocampi - слой мшистых волокон, идущих от зернистых клеток зубчатой извилины. Резко контрастирует с интенсивной окраской вышеперечисленных проводящих путей бóльшая (вентральная) часть мозолистого тела, практически полностью лишённая окраски на НФ. При иммуногистохимическом выявлении белка в микротрубочках альфа-тубулина, характерного для нервных волокон, мозолистое тело не отличалось от других проводящих путей по степени его экспрессии [1]. Среди участков серого вещества головного мозга высоким содержанием низкомолекулярных белков НФ выделялись цингулярная и ретросплениальная кора. Причём локализация данных белков имела чётко выраженный ламинарный характер: наблюдались два слоя интенсивной экспрессии белков НФ, которые перемежались с более слабо окрашенными слоями. Интересно, что поверхностные полосы интенсивной и слабой окраски в цингулярной и ретросплениальной коре приходятся на слой I, что подтверждает данные о его сложной ультраструктуре [7]. При этом ламинарность распределения НФ наблюдается только в цингулярной и ретросплениальной коре, но не во вторичной двигательной коре, которая окрашена также интенсивно, но гомогенно. В более латеральных отделах неокортекса, где НФ-иммунореактивность очень слабая, выделяются отдельные корковые слои с несколько более выраженной иммуноокраской, интенсивность которой варьирует в разных зонах коры. В частности, в первичной соматосенсорной коре слой IV выделяется чётко локализованной, умеренной по интенсивности НФ-иммунореактивностью. Ранее при иммуногистохимическом исследовании белка в микротрубочках альфа-тубулина нами также наблюдалась ламинарность распределения данного белка в коре большого мозга крысы, причём интенсивность иммунореактивности на альфа-тубулин по слоям была однотипной во всех корковых областях [1]. В настоящем исследовании при использовании иммуногистохимической методики также можно было ожидать примерно одинаковой по интенсивности и однотипной послойной локализации низкомолекулярных белков НФ в цингулярной и других отделах коры мозга. Однако распределение НФ в коре оказалось крайне неравномерным: интенсивная экспрессия данных белков наблюдалась в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре, тогда как в других корковых зонах она была значительно слабее или практически отсутствовала. В то же время, ламинарность распределения низкомолекулярных белков в НФ отмечалась как в области поясной извилины, так и в других корковых зонах (кроме вторичной двигательной коры), хотя там интенсивность НФ-иммуноокрашивания была значительно слабее. Это наблюдение указывает на то, что послойный характер распределения проводящих волокон в коре мозга выявляется с помощью низкомолекулярных белков НФ не хуже, чем с помощью альфа-тубулина или других белков-маркеров нервных волокон [6], но позволяет выявить различие проводящих волокон в разных (в том числе соседних) областях коры по количеству содержащихся в них низкомолекулярных белков НФ. Наиболее богаты низкомолекулярными белками НФ нервные проводники поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коры. Учитывая этот обнаруженный факт, можно предположить, что дорсальная часть мозолистого тела, интенсивно экспрессирующая НФ, содержит именно каллозальные аксоны цингулярной, ретросплениальной и вторичной двигательной коры. Проведённое исследование показало пригодность использования антител к низкомолекулярным белкам НФ (клон 2F11) в качестве эффективного маркера нервных волокон для нейроанатомических исследований и анализа миелоархитектоники головного мозга. Этот маркер не только выявляет нервные проводники, но позволяет обнаружить их химическую гетерогенность по наличию и концентрации низкомолекулярных белков НФ. Настоящее исследование показало, что нервные волокна в коре мозга значительно различаются по содержанию низкомолекулярных белков НФ в зависимости от области коры, а волокна с максимальным количеством низкомолекулярных белков НФ локализованы в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре. Есть основания предполагать, что они организуют каллозальные проекции в наиболее дорсальной полоске мозолистого тела. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Э. К. Сбор и обработка материала: Д. А. С., О. В. К., О. С. А. Анализ и интерпретация данных: Д. Э. К., О. С. А., И. П. Г. Написание текста: О. С. А., И. П. Г. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

Об авторах

Игорь Павлович Григорьев

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Ольга Сергеевна Алексеева

Институт экспериментальной медицины; Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии; лаборатория сравнительной физиологии дыхания 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Ольга Викторовна Кирик

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дина Азатовна Суфиева

Институт экспериментальной медицины

лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: iemmorphol@yandex.ru
лаборатория функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

Дополнительные файлы