DISTRIBUTION OF NEUROFILAMENT LIGHT CHAIN PROTEINS IN RAT BRAIN CINGULATE CORTEX

全文:

Одной из структур головного мозга человека, изучение которой в последнее время вызывает пристальный интерес специалистов в области нейрокогнитивных исследований, является кора поясной извилины (цингулярная кора), расположенная на медиальной поверхности головного мозга между мозолистым телом и поясной бороздой [16]. Данная область мозга является составной частью лимбической системы и получает афферентные сигналы от передней группы ядер таламуса. Эфферентные сигналы из цингулярной коры идут в парагиппокампальную извилину и далее в гиппокамп. Кроме того, цингулярная кора имеет многочисленные двусторонние связи с лобной, теменной и затылочной корой полушарий большого мозга. В цитоархитектоническом отношении цингулярная кора довольно неоднородна. По классификации К. Бродмана [8], в ней различают семь полей. Но в связи с тем, что точные границы между полями практически невозможно визуально различить на томограммах, в последнее время в цингулярной коре выделяют только три крупных отдела: переднюю (поля 24 и 33), заднюю (поля 23 и 31) и ретросплениальную (поля 26, 29 и 30) кору. Иногда в задней цингулярной коре дополнительно выделяют вентральную (поле 23) и дорсальную (поле 31) части [2]. Поясная кора принимает участие в осуществлении важнейших реакций организма, включающих регуляцию вегетативных и эндокринных функций, локомоции, ноцицепции, обработку поступающей извне информации, оценку эмоций, а также - в реализации когнитивных функций, таких как ожидание награды, принятие решений, эмпатии. Вследствие этого она играет важнейшую роль в социальных взаимоотношениях и при психопатологических состояниях, в первую очередь, при депрессии и шизофрении [2, 9-10, 13]. Исследование структурных особенностей нейронов и их отростков в этой области мозга в норме является важной задачей для оценки влияния их изменения при патологии на когнитивные и психические нарушения функций мозга. Для оценки состояния нервных проводников существуют небольшое количество маркеров, оптимальные среди них - белки нейрофиламентов, присутствующие преимущественно в отростках нервных клеток. Нейрофиламенты (НФ) - один из видов промежуточных филаментов, внутриклеточных компонентов цитоскелета, специфичных для нейронов. Они необходимы для поддержания сложной формы нервной клетки и ее отростков и обеспечения медленного аксонального транспорта. Среди белков НФ выделяют три группы, различающиеся по молекулярной массе: низкомолекулярные с молекулярной массой 68-73 килодальтон, белки промежуточной массы - 140-160 и высокомолекулярные - 195-200 килодальтон [3]. Иммуногистохимическая реакция на НФ широко используется в нейрогистологических исследованиях [5, 11-12, 14-15]. Цель настоящего исследования - изучение особенностей распределения низкомолекулярных белков НФ в поясной коре и прилежащих к ней отделах переднего мозга крысы с использованием моноклональных антител, специфических для НФ с молекулярной массой 70 килодальтон, и оценка возможности использования этой методики для исследования особенностей организации миелоархитектоники в коре и других структурах мозга. Материал и методы. В работе использован головной мозг половозрелых (5-6 мес) крыс-самцов линии Вистар (7 особей). При содержании животных и выведении их из эксперимента руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.), Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г. План проведения работ утвержден и одобрен на заседании локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 2 от 13.11.2015 г.). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [4], обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой методике. Готовили срезы толщиной 5 мкм. После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере S1700 (Dako, Дания). Локализацию низкомолекулярных белков НФ определяли с помощью мышиных моноклональных антител к НФ человека (клон 2F11, разведение 1:300, номер по каталогу М 0762, Dako, Дания). Для выявления комплекса антиген-антитело для световой микроскопии применяли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой, из набора MACH2 Universal HRP polymer (Biocare Medical, США). Для визуализации продукта иммуноцитохимической реакции при световой микроскопии использовали хромоген DAB+ (Dako, Дания). После проведения реакции часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином. Препараты исследовали под микроскопом Leica DM750 (Leica, Германия), фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Препараты срезов мозга сканировали с помощью сканера Epson Perfection V500 Photo (Epson, Япония). Локализацию областей мозга определяли по стереотаксическому атласу [16]. Результаты исследования. Иммуноцитохимическое выявление низкомолекулярных белков НФ в поясной коре и прилежащих к ней отделах переднего мозга крысы показало её неравномерное распределение (рисунок, а). Очень высокая интенсивность окрашивания на НФ обнаруживается в поясной коре и белом веществе двигательной, соматосенсорной и инсулярной коры. В гиппокампе также наблюдается выраженная неоднородность окрашивания. Наибольшая интенсивность окраски на НФ наблюдалась в бахромке (фимбрии) гиппокампа, наименьшая - в медиальной части зоны СА1, в латеральной части зоны СА2 и stratum lucidum hippocampus. Лишь интенсивность окраски в фимбрии сопоставима с таковой в близлежащей поясной извилине, в остальных областях гиппокампа она значительно слабее. В большинстве зон коры большого мозга окраска слабая, а в инсулярной и пириформной коре практически отсутствует. В соматосенсорной коре можно заметить слабую или умеренную НФ-иммунореактивность, в частности в IV слое соматосенсорной коры. Наиболее интенсивная среди корковых областей НФ-иммунореактивность наблюдается в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре. НФ-иммунореактивность была чётко ограничена данной областью неокортекса, резко ослабевая в более латеральных зонах (см. рисунок, б). При этом экспрессия НФ в цингулярной и ретросплениальной коре имела чёткое послойное распределение в верхних слоях: интенсивная окраска в поверхностной части I слоя сменялась слабой иммуноокраской в подлежащей части слоя I, слой II прокрашивался интенсивно, а слой III - слабо. Более глубокие слои имели относительно гомогенное и достаточно сильное окрашивание, хотя и слабее по сравнению с ярко окрашенными полосами в слоях I и II. При большем увеличении в ретросплениальной коре выявлялось большое число волокон, иммунопозитивных к белкам НФ. НФ-иммунопозитивных клеточных тел не наблюдалось. В области поясной коры волокна шли ростро-каудально, а в прилегающих зонах - расходились радиально. Отростки клеток радиально пересекали все слои коры (см. рисунок, в). В слое I коры около поверхности радиальные отростки имели большую степень ветвления и были разнонаправлены. В мозолистом теле под цингулярной корой выявлялись два слоя НФ-иммунопозитивных структур: тонкий дорсальный слой с очень интенсивной окраской и слабо окрашенный вентральный слой. Также очень интенсивной окраской отличалась область пояса, подлежащая под цингулярной корой. Обсуждение полученных дан ных. Низкомолекулярные белки НФ, выявляемые с помощью иммуногистохимии (антитела клона 2F11), экспрессируются в головном мозгу крысы с выраженной неравномерностью. Наиболее интенсивно окрашиваются на НФ проводящие пути: пояс, узкая дорсальная полоска мозолистого тела, белое вещество двигательной, соматосенсорной и инсулярной коры и stratum lucidum hippocampi - слой мшистых волокон, идущих от зернистых клеток зубчатой извилины. Резко контрастирует с интенсивной окраской вышеперечисленных проводящих путей бóльшая (вентральная) часть мозолистого тела, практически полностью лишённая окраски на НФ. При иммуногистохимическом выявлении белка в микротрубочках альфа-тубулина, характерного для нервных волокон, мозолистое тело не отличалось от других проводящих путей по степени его экспрессии [1]. Среди участков серого вещества головного мозга высоким содержанием низкомолекулярных белков НФ выделялись цингулярная и ретросплениальная кора. Причём локализация данных белков имела чётко выраженный ламинарный характер: наблюдались два слоя интенсивной экспрессии белков НФ, которые перемежались с более слабо окрашенными слоями. Интересно, что поверхностные полосы интенсивной и слабой окраски в цингулярной и ретросплениальной коре приходятся на слой I, что подтверждает данные о его сложной ультраструктуре [7]. При этом ламинарность распределения НФ наблюдается только в цингулярной и ретросплениальной коре, но не во вторичной двигательной коре, которая окрашена также интенсивно, но гомогенно. В более латеральных отделах неокортекса, где НФ-иммунореактивность очень слабая, выделяются отдельные корковые слои с несколько более выраженной иммуноокраской, интенсивность которой варьирует в разных зонах коры. В частности, в первичной соматосенсорной коре слой IV выделяется чётко локализованной, умеренной по интенсивности НФ-иммунореактивностью. Ранее при иммуногистохимическом исследовании белка в микротрубочках альфа-тубулина нами также наблюдалась ламинарность распределения данного белка в коре большого мозга крысы, причём интенсивность иммунореактивности на альфа-тубулин по слоям была однотипной во всех корковых областях [1]. В настоящем исследовании при использовании иммуногистохимической методики также можно было ожидать примерно одинаковой по интенсивности и однотипной послойной локализации низкомолекулярных белков НФ в цингулярной и других отделах коры мозга. Однако распределение НФ в коре оказалось крайне неравномерным: интенсивная экспрессия данных белков наблюдалась в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре, тогда как в других корковых зонах она была значительно слабее или практически отсутствовала. В то же время, ламинарность распределения низкомолекулярных белков в НФ отмечалась как в области поясной извилины, так и в других корковых зонах (кроме вторичной двигательной коры), хотя там интенсивность НФ-иммуноокрашивания была значительно слабее. Это наблюдение указывает на то, что послойный характер распределения проводящих волокон в коре мозга выявляется с помощью низкомолекулярных белков НФ не хуже, чем с помощью альфа-тубулина или других белков-маркеров нервных волокон [6], но позволяет выявить различие проводящих волокон в разных (в том числе соседних) областях коры по количеству содержащихся в них низкомолекулярных белков НФ. Наиболее богаты низкомолекулярными белками НФ нервные проводники поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коры. Учитывая этот обнаруженный факт, можно предположить, что дорсальная часть мозолистого тела, интенсивно экспрессирующая НФ, содержит именно каллозальные аксоны цингулярной, ретросплениальной и вторичной двигательной коры. Проведённое исследование показало пригодность использования антител к низкомолекулярным белкам НФ (клон 2F11) в качестве эффективного маркера нервных волокон для нейроанатомических исследований и анализа миелоархитектоники головного мозга. Этот маркер не только выявляет нервные проводники, но позволяет обнаружить их химическую гетерогенность по наличию и концентрации низкомолекулярных белков НФ. Настоящее исследование показало, что нервные волокна в коре мозга значительно различаются по содержанию низкомолекулярных белков НФ в зависимости от области коры, а волокна с максимальным количеством низкомолекулярных белков НФ локализованы в поясной, ретросплениальной и вторичной двигательной коре. Есть основания предполагать, что они организуют каллозальные проекции в наиболее дорсальной полоске мозолистого тела. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Э. К. Сбор и обработка материала: Д. А. С., О. В. К., О. С. А. Анализ и интерпретация данных: Д. Э. К., О. С. А., И. П. Г. Написание текста: О. С. А., И. П. Г. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

I. Grigoriyev

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology 12 Academician Pavlov Str., St. Petersburg 197376

O. Alekseyeva

Institute of Experimental Medicine; I. M. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology; Laboratory of Comparative Respiratory Physiology 12 Academician Pavlov Str., St. Petersburg 197376; 44 Moris Torez Avenue, St. Petersburg 194223

O. Kirik

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology 12 Academician Pavlov Str., St. Petersburg 197376

D. Sufiyeva

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology 12 Academician Pavlov Str., St. Petersburg 197376

D. Korzhevskiy

Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System, Department of General and Special Morphology 12 Academician Pavlov Str., St. Petersburg 197376

参考

补充文件