MORPHOMETRIC ANALYSIS OF THE ULTRASTRUCTURE OF HEPATOCYTE MITOCHONDRIA IN THE INTAСT RATS

全文:

Развитие современных морфологических исследований в различных областях экспериментальной биологии и медицины, а также в области патологии человека базируется на совершенствовании методических подходов. Микроскопическое и особенно электронно-микроскопическое исследование, углубляяпредставленияопатологическом процессе, одновременно увеличивают вероятность ошибочных заключений в связи с ограниченным объемом изучаемого органа. Описательный характер этих исследований недостаточен для глубокого анализа наблюдаемых патологических изменений и их взаимосвязей. Для полноценной морфологической оценки и улучшения диагностического процесса необходимы комплексные морфометрические исследования, возможности которых возрастают с использованием современной компьютерной техники. В настоящее время особое внимание уделяется ультраструктурным преобразованиям митохондрий - важных органелл в клетках живых организмов. Митохондрии имеют большое значение для нормального функционирования клеток. Они занимают ключевое положение в метаболическом процессе благодаря их энергетической функции, а также участии в апоптозе, контроле уровня цитозольного иона кальция, липидном гомеостазе, синтезе стероидов, синтезе гема, врожденном иммунном ответе и метаболической сигнализации клеток [7, 19]. Митохондрии - это динамичные органеллы, которые постоянно сливаются и делятся, движутся вдоль цитоскелетных путей к участкам с высокой потребностью в энергии. Совокупность этих процессов носит название митохондриальной динамики. Баланс между слиянием и делением определяет строение митохондрий, форма которых может варьировать от небольших сфер/овалов и коротких трубочек до удлиненных трубочек и разветвленных сетей в зависимости от типа клеток в разных органах [10]. На основе морфологической 2D-картины, наблюдаемой при трансмиссионной электронной микроскопии, некоторые исследователи выделяют два различных способа деления митохондрий [9]. Обе эти разновидности были зарегистрированы в кардиомиоцитах у крыс. Преобладающим является способ, связанный с удлинением одной кристы, пока она не пересечет всю ширину митохондрии. Последующая инвагинация наружной мембраны, в конечном итоге, приводит к разделению органеллы. Второй вид процесса представляет собой «pinching» («перехватывание», «отщипывание»), при котором сужение органеллы в определенных поверхностных участках приводит к ее истончению. При встрече мембран с противоположных сторон происходит деление митохондрии. Когда деление осуществляется в режиме «перехватывания», элементы гранулярного саркоплазматического ретикулума всегда являются связанными с областями сужения митохондрий. Теми же авторами показано, что в культивируемых фибробластах человека деление митохондрий происходит вторым («pinching») из вышеописанных способов [8]. Циклические слияния и деления митохондрий необходимы для поддержания их числа, качества и функциональной активности. Установлено, что митохондриальная динамика не только управляет их мембранным потенциалом, устойчивостью митохондриальной ДНК и митофагией, но и связана с регуляцией многих клеточных процессов, включая ответ на напряжение, клеточный цикл и апоптоз [21]. Одна из важнейших функций митохондрий - участие в регуляции и осуществлении каскада событий, включенных в программированную клеточную смерть [12, 13]. В клетках, подвергающихся апоптозу, наблюдаются изменения митохондриальной морфологии, которые затрагивают как размеры и форму органелл, так и их внутреннюю архитектонику, включая число, длину, форму крист и характеристику кристных соединений [20, 21]. Изменение митохондриальной динамики под влиянием различных факторов приводит к изменениям структуры данных органелл и их перераспределению в клетке [3, 17, 20]. Тесная корреляционная связь между структурой митохондрий и их функцией заставляет исследователей обращаться к детальному изучению морфологических характеристик этих органелл при различных патологических состояниях и метаболических воздействиях [17, 18]. В частности, ремоделирование митохондрий происходит при ограничении доступности нутриентов, в процессе старения организма, при окислительном стрессе, а также при развитии раковых опухолей и целого ряда нейродегенеративных и метаболических расстройств [2, 10]. Топология внутренней митохондриальной мембраны также ремоделируется при изменении метаболического статуса органеллы и под воздействием ряда других эффекторов [14, 22]. В соответствии с центральной ролью митохондрий в клеточном метаболизме и регуляции апоптоза эти органеллы являются ключевой мишенью также при лекарственных и токсических поражениях печени и других органов [6, 11, 15]. При тестировании новых медикаментозных препаратов токсикологические исследования проводятся на экспериментальных животных [5]. В связи с этим для оценки ультраструктурных изменений, наблюдающихся в тканях при моделировании токсических воздействий и иных патологических состояний, целесообразно проведение детального морфометрического исследования митохондрий у интактных животных. Однако в литературе отсутствуют систематизированные обзоры по морфометрическому анализу митохондрий печени, что и послужило стимулом к проведению данного исследования. Цель работы - комплексная морфометрическая оценка ультраструктуры митохондрий гепатоцитов на срезах печени у интактных крыс. Материал и методы. Исследование проведено на 5 белых нелинейных крысах-самцах массой 232,5±20,35 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Эксперимент выполнен с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными. Проведение исследования одобрено комитетом по биомедицинской этике учреждения образования «Гродненский государственный медицинский университет» (протокол № 2 от 06.01.2015 г.). Ультраструктурное исследование проводили в образцах печени, фиксированных 1 % раствором четырехокиси осмия (OsO4, Fluca, США) на 0,1М буфере Миллонига (Япония) при увеличениях 10 000-50 000 и ускоряющем напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовали комплекс из цифровой камеры Olympus Mega View III (Германия) и программы iTEM. Обработку изображений осуществляли с использованием морфометрических инструментов программы «iTEM». Программа iTEM обладает рядом стандартных встроенных алгоритмов для проведения морфометрии. В процессе комплексной оценки морфологических изменений митохондрий в гепатоцитах использовались несколько групп параметров. Количественные параметры: средняя суммарная площадь сечений митохондрий на 100 мкм2 цитоплазмы (мкм2); средняя площадь сечения одной митохондрии на срезе (мкм2); число митохондрий на 100 мкм2 площади цитоплазмы; относительное число измененных митохондрий (%); относительное число делящихся митохондрий (%), при этом считали делящейся органеллу гантелевидной формы, в которой диаметр в области сужения составляет 50 % или менее минимального поперечного диаметра митохондрии вне этой области; средний периметр одной митохондрии (мкм); средняя длина крист в одной митохондрии (мкм); расширение интракристных промежутков (мкм); концентрация внутренних мембран митохондрии (КВММ) на постоянной площади клетки (мкм-1) [1]. КВММ рассчитывали по формуле: КВММ=(Р+2L) • n, где Р - средний периметр митохондрии; L - средняя длина крист в 1 митохондрии; n - число митохондрий на единицу тестируемой площади (площадь одного поля зрения) цитоплазмы гепатоцита. Для подсчета отбирали и сканировали 10 непересекающихся снимков, содержащих не менее 30 сечений митохондрий, при ув. 50 000. Комплексные параметры: • фактор формы (FF) в интерфейсе программы «Shape factor», характеризующий «компактность» изучаемого объекта и степень разветвленности (для сферических объектов равен 1, для других форм <1, рассчитывается по формуле: Р2/4S, где Р - периметр объекта, S - его площадь на срезе). Топологический параметр: фактор элонгации, позволяющий оценить потерю округлости изучаемого объекта, определяется как отношение длины к ширине объекта. Объемные параметры: соотношение сторон в интерфейсе программы «Aspect ratio», определяет отношение максимальной ширины к высоте прямоугольника, в который помещается изучаемый объект; диаметр эквивалентного круга (Equivalent Cycle Diameter, ECD) определяет диаметр круга с площадью, эквивалентной площади измеряемого объекта; • сферичность в интерфейсе программы «Sphericity», определяет округлость измеряемого объекта. Денситометрический параметр: относительная электронная плотность матрикса митохондрий в интерфейсе программы «Gray value», определяет средний уровень всех оттенков серого цвета изучаемого объекта (см. рис. 2, з). В каждом препарате анализировали 20 непересекающихся полей зрения при увеличении 20 000 (площадь 1 поля зрения равна 31,59 мкм2) и 10 полей зрения при увеличении 50 000 (площадь 1 поля зрения равна 4,94 мкм2). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 10.0 (серийный номер AXAR207F394425FA-Q). Оценку распределения осуществляли с помощью критерия Shapiro-Wilk. Данные представлены в виде медианы (Ме) и 25-75 % интерквартильного интервала. Результаты исследования. Визуально в гепатоцитах у интактных крыс выявлялись многочисленные митохондрии, равномерно распределенные в цитоплазме, местами образуя небольшие скопления в области ядра или на сосудистом полюсе, либо в непосредственной близости к латеральной поверхности клетки. Практически все органеллы содержали матрикс умеренной электронной плотности и умеренное число крист, ориентированных преимущественно поперек длинной оси органелл или имеющих неупорядоченную ориентацию. Интракристные промежутки не были расширены. Митохондрии отличались полиморфизмом, при этом в одних гепатоцитах преобладали органеллы овальной и бобовидной формы (рисунок, а), в других - удлиненные (рисунок, б). Среди основной популяции органелл встречались гипертрофированные митохондрии нерегулярной формы, ракеткообразные, а также митохондрии гантелевидной формы (см. рисунок, в). По нашим наблюдениям в гепатоцитах у крыс деление митохондрий осуществляется «перехватыванием». На электронномикроскопических снимках кристы в виде поперечной перегородки часто отчетливо не выявляются или отсутствуют, хотя митохондрии имеют явную гантелевидную форму. Согласно указанному в методике критерию, гантелевидные митохондрии учитывались нами как делящиеся. В гепатоцитах у интактных крыс также обнаруживались единичные измененные формы органелл, имеющие просветленный матрикс и укороченные кристы или уменьшенное их число (см. рисунок, г). Такие митохондрии считаются низкоэнергетическими и имеют «пониженную» биосинтетическую функцию. Отмечалась тесная топографическая связь митохондрий с гранулярной эндоплазматической сетью (ГрЭС) (см. рисунок), с цистернами которой ассоциировались многочисленные рибосомы, что отражает интенсивность биосинтеза белка. Кроме того, наблюдался тесный контакт митохондрий с липидными включениями (см. рис. 3, в, г). С помощью программы iTEM нами выполнены морфометрические измерения митохондрий в гепатоцитах у интактных крыс (таблица). Обсуждение полученных данных. Проведенные исследования показали, что митохондрии в печени у половозрелых нелинейных интактных крыс многочисленные и занимают около 1/3 площади цитоплазмы. Величина фактора формы подтверждает, что митохондрии в печени у интактных крыс отличаются полиморфизмом и имеют разветвленную форму. Значение фактора элонгации свидетельствует о высоком содержании удлиненных митохондрий, которые при наличии многочисленных крист и матрикса умеренной электронной плотности считаются функционально активными. Высока вероятность, что подобные митохондрии являются результатом слияния либо впоследствии поделятся [4]. Таким образом, проведенное комплексное морфометрическое исследование митохондрий гепатоцитов у интактных нелинейных крыс может использоваться для сравнительной характеристики изменений митохондриальной структуры, возникающих при моделировании различных патологических состояний, в том числе лекарственных поражений печени. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: М. Н. К., Р. И. К., О. Б. О. Сбор и обработка материала: М. Н. К., Р. И. К., О. Б. О. Статистическая обработка данных: М. Н. К., О. Б. О. Анализ и интерпретация данных: М. Н. К., Р. И. К., О. Б. О. Написание и редактирование текста: М. Н. К., Р. И. К., О. Б. О. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

M. Kurbat

Grodno State Medical University

Email: vwmisha@mail.ru
Scientific Research Laboratory 80 Gorkiy St., Grodno, Belarus 230009

R. Kravchuk

Grodno State Medical University

Scientific Research Laboratory 80 Gorkiy St., Grodno, Belarus 230009

O. Ostrovskaya

Grodno State Medical University

Scientific Research Laboratory 80 Gorkiy St., Grodno, Belarus 230009

参考

补充文件