Morphometric features of intramural autonomic nerve ganglia of the intermuscular and submucous plexuses of the small and large intestine of rats in postnatal ontogenesis

全文:

Обоснование

Регуляция функции желудочно-кишечного тракта осуществляется сложной сетью интрамуральных узлов, которые относят к особому отделу автономной (вегетативной) нервной системы – метасимпатическому [1]. Интрамуральные узлы кишки млекопитающих и человека организованы в два основных нервных сплетения: межмышечное (МС) и подслизистое (ПС). МС и ПС сплетения состоят из скоплений нейронов и глиальных клеток в виде сети узлов, а также нервных волокон, связывающих эти ганглии между собой и эффекторными тканями. МС лежит между продольными и кольцевыми мышечными слоями, тогда как ПС находится внутри соединительной ткани подслизистой оболочки. ПС состоит из одного слоя довольно небольших ганглиев у грызунов, но у более крупных млекопитающих и человека представлено двумя слоями [2, 3].

Ранее считалось, что нейроны МС регулируют моторику желудка и кишечника, а нейроны ПС - транспорт ионов и воды через эпителий кишечника, а также секреторную функцию желез. Однако в последние годы было установлено, что связи сплетений являются более сложными. Доказано, что нейроны внешнего слоя ПС могут посылать волокна к циркулярным гладким мышцам, участвуя тем самым в регуляции моторики кишки, а также к нейронам симпатических превертебральных узлов [4].

Гистоархитектоника ганглиев МС и ПС животных различных видов в современной литературе изучена достаточно подробно [5-7]. Применение современных методов исследования, включая иммуногистохимические, позволило качественно и количественно охарактеризовать морфологию узлов различных отделов пищеварительной системы [8, 9].

В ходе постнатального развития происходит увеличение размеров нейронов узлов автономной нервной системы, изменение их нейрохимических характеристик [10-12]. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что к моменту рождения ПС у грызунов отсутствует, и его формирование происходит после рождения [13, 14].

Тем не менее, имеющиеся количественные данные относительно формы и площади узлов, числа нейронов в узлах, размеров нейронов у животных различных возрастных групп от момента рождения до наступления старости являются неполными и отрывочными.

Цель

Целью исследования явилось исследование морфометрических особенностей интрамуральных узлов МС и ПС тонкой и толстой кишки крысы в постнатальном онтогенезе.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одноцентровое сплошное неконтролируемое неослеплённое исследование.

Работа выполнена на крысах различных возрастных групп: новорожденных, 10-, 20-, 30-, 60-суточных, 24-месячных крысах (по 5 в каждой возрастной группе). Эксперименты проводились в соответствии с отечественными и международными положениями о гуманном обращении с животными. Эвтаназию животных осуществляли летальной дозой уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно).

Процедура иммуногистохимического анализа подробно описана в наших предыдущих работах [15]. Животных перфузировали вначале раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (PBS), затем 4% pаcтвоpом паpафоpмальдегида на PBS. После перфузии участки двенадцатиперстной кишки и поперечной ободочной кишки длиной 0,5 см и извлекались и дофиксировались в той же смеси в течение 1-2 часов. Полученный материал разрезался вдоль оси кишки и расправлялся. На криостате изготавливались серийные продольные срезы толщиной 12 мкм.

Для выявления нервных структур использовался универсальный нейроиммуногистологический маркёр - протеиновый генный продукт 9,5 (PGP 9.5) [8, 9]. Использовались первичные антитела морской свинки к PGP9.5 (Abcam, США, разведение 1:200). Вторичные  антитела были конъюгированы с флюорохромом - индокарбоцианином (Cy3, Jackson, США, разведение 1:100), дающим красную флюоресценцию.

Визуализацию препаратов на флуоресцентном микроскопе Olympus BX43 с соответствующим набором светофильтров (Япония). Фотографирование проводили с использованием цифровой CCD камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Размеры отдельных нейронов и узлов определяли при помощи некоммерческой программы Fiji (Версия 2.11.0, США). Только нервные клетки, содержащие ядро, были включены в анализ. При отборе полей зрения для микрофотографирования использовался метод наименьших квадратов [16].

 

Этическая экспертиза

На проведение исследования получено разрешение Этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (№ 29 от 21.02.2019 г.).

Статистический анализ

Размер выборки рассчитывался на основании ресурсного уравнения по Mead [17], где число животных для каждого возраста считали равным 5. Использовался метод многоэтапной гнездной выборки, при котором подсчет производился на 5 ганглиях в каждом из 5 срезов каждого из 5 животного для каждого сплетения, отдела кишечника и возраста [16].

Статистический анализ данных и построение графиков проводился с использованием программ Sigma Plot (Systat Software, США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Проверка выборки на нормальность осуществлялась с использованием теста Шапиро-Уилка. Для нормального распределения величины представлены как средняя арифметическая ± стандартное отклонение, М±SD (n), где n - число значений, использовавшихся для подсчета среднего. Для оценки различий между разными группами использовали непарный параметрический one-way ANOVA тест. За уровень статистической значимости был взят p<0,05.

Результаты

Нейроны, содержащие универсальный нейроиммуногистологический маркёр PGP9.5, обнаруживались в тонкой и толстой кишке в МС и ПС с момента рождения и на протяжении всех исследованных периодов.

У всех животных ганглии МС в тонкой кишке были расположены параллельно, тогда как в толстой кишке предпочтительной ориентации ганглиев не отмечено. Ганглии МС были соединены между собой короткими пучками нервных волокон (рис. 1). Ганглии ПС были меньше по размерам, имели звездчатую неправильную форму и соединялись более тонкими пучками волокон (рис. 2).

У новорожденных крыс число ганглиев на 1 мм длины тонкой и толстой кишки было максимальным, а площадь ганглиев минимальной. В постнатальном онтогенезе происходило снижение числа ганглиев на 1 мм длины и увеличение площади ганглиев тонкой и толстой кишки в обоих сплетениях (рис. 3, 4).

Средняя площадь узлов МС возрастала с момента рождения до 60 суток жизни от 3865±335 до 8388±973 мкм² (тонкая кишка) и от 3657±283 до 7758±871 мкм² (толстая) и далее достоверно не изменялась (рис. 3). Не было выявлено достоверных различий между данным параметром в тонкой и толстой кишке (p>0,05).

В ПС тонкой и толстой кишки средняя площадь узлов также возрастала с момента рождения до 30 суток жизни от 520±137 до 1956±564 мкм² (тонкая кишка) и от 240±33 до 871±67 мкм² (толстая), после чего оставалась неизменной (рис. 3). Тем не менее, она была в несколько раз меньше по сравнению с МС в каждой возрастной группе. При этом средняя площадь узлов ПС в толстой кишке была достоверно меньше по сравнению с тонкой во всех возрастных группах (p<0,05).

В МС средняя плотность расположения узлов на 1 мм² площади уменьшалась в тонкой и толстой кишке (рис. 4). При этом в тонкой кишке уменьшение плотности происходило с момента рождения (54±6,2) до 60 суток (13±2,3), а в толстой – от момента рождения (64±6,2) до 12 месяцев жизни (15±2,1). Не было отмечено достоверной разницы по этому показателю между различными возрастными группами за исключением 60 суток, где средняя плотность расположения узлов на 1 мм² площади была достоверно выше в толстой кишке (p<0,05).

В ПС значение данного параметра также снижалось в первые 60 суток жизни от 348±45,1 до 61±6,4 (тонкая кишка) и от 276±38,3 до 81±9,1 (толстая). При этом в первые 10 суток жизни не наблюдалось достоверной разницы по этому показателю между тонкой и толстой кишкой. В то же время, начиная с 20 суток жизни и до старости плотность расположения узлов была выше в толстой кишке по сравнению с тонкой (p<0,05).

Среднее число нейронов в одном узле в МС было постоянным в постнатальном онтогенезе и не отличалось между различными возрастными группами, а также тонкой и толстой кишкой, при этом значение варьировали между 19±2,7 и 22±2,8 (рис. 5). Однако в ПС всех крыс в одном узле в среднем выявлялось меньшее число нейронов по сравнению с МС. При этом в ПС новорожденных крысят выявлялось меньше нервных клеток в одном узле (6±0,6 в тонкой и 7±0,5 в толстой кишке) по сравнению с 10-суточными крысятами (11±2,1 в тонкой и 12±2,8 в толстой кишке) (p<0,05). Далее количество нейронов в ПС между 10-суточными и более взрослыми животными в обоих отделах кишечника достоверно не отличалось (p>0,05).

Средняя площадь сечения нейронов возрастает с момента рождения до 60 суток жизни в МС и ПС тонкой и толстой кишки (рис. 6). Между данными показателями в тонкой и толстой кишке не было отмечено достоверных отличий. При этом начиная с 10-суточного возраста до 60 суток, средняя площадь сечения нейронов МС становится достоверно большей по сравнению с ПС (p<0,05). У старых крыс в ПС средняя площадь сечения нейронов опять возрастает по сравнению с предыдущими возрастными группами.

 

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют, что у крысы МС и ПС тонкой и толстой кишки присутствуют к моменту рождения. В постнатальном онтогенезе происходит увеличение размеров нейронов, а также самих узлов МС и ПС. В МС число нейронов в узле не меняется после рождения животного, в то время как у крыс число нейронов ПС достоверно увеличивается в первые 10 суток жизни.

В отличие от прежних представлений [13, 14], нам удалось доказать наличие сформированного ПС уже у новорожденных крыс. Тем не менее, средняя площадь ганглиев и число нейронов в узле ПС меньше по сравнению с МС в каждой возрастной группе. При этом число нейронов в ПС возрастает в первые 10 суток жизни и далее достоверно не меняется.

Площадь узлов возрастает, а плотность нейронов и ганглиев на единице площади кишки снижается в раннем постнатальном онтогенезе, что соответствует литературным данным [18, 19]. Тем не менее, имеются противоречивые данные относительно изменения числа нейронов и плотности узлов на срезах у старых животных. Ряд авторов утверждает, что при старении происходит уменьшение числа нейронов, прежде всего в узлах МС [20, 21]. Результаты нашего исследования, а также данные других источников [7, 22] свидетельствуют, что значимого снижения числа нейронов в узлах при старении не происходит. Вероятно, различия между источниками можно объяснить видовыми различиями и особенностями примененных методик. Также есть данные, что при старении не происходит снижения общего числа нейронов, а происходит изменение нейрохимического состава. Например, уменьшается доля холинергических нейронов, но возрастает процент клеток, экспрессирующих нейрональную синтазу оксида азота [23, 24].

Размеры нейронов увеличиваются в раннем постнатальном онтогенезе в первые два месяца жизни в МС и ПС. Интересно, что у старых крыс размеры нейронов в МС остаются постоянными, но возрастают в ПС. Имеющиеся литературные данные на этот счет противоречивы [20, 21].

Заключение

В постнатальном онтогенезе в первые 30 суток жизни происходит увеличение размеров узлов МС и ПС и снижение плотности их расположения на единицу поверхности тонкой и толстой кишки. Форма узлов и число нейронов в узлах МС в постнатальном онтогенезе не меняется. Ганглии ПС, в отличие от МС тонкого и толстого кишечника крыс к моменту рождения являются незрелыми. Формирование гистотопографии сети узлов ПС происходит в первые 10 суток жизни. Таким образом, развитие МС и ПС кишечника происходит неравномерно по темпам и срокам, что нужно учитывать в экспериментальной практике, а также разработке новых лекарственных препаратов для гастроэнтерологии в педиатрии.

Обоснование

Регуляция функции желудочно-кишечного тракта осуществляется сложной сетью интрамуральных узлов, которые относят к особому отделу автономной (вегетативной) нервной системы – метасимпатическому [1]. Интрамуральные узлы кишки млекопитающих и человека организованы в два основных нервных сплетения: межмышечное (МС) и подслизистое (ПС). МС и ПС сплетения состоят из скоплений нейронов и глиальных клеток в виде сети узлов, а также нервных волокон, связывающих эти ганглии между собой и эффекторными тканями. МС лежит между продольными и кольцевыми мышечными слоями, тогда как ПС находится внутри соединительной ткани подслизистой оболочки. ПС состоит из одного слоя довольно небольших ганглиев у грызунов, но у более крупных млекопитающих и человека представлено двумя слоями [2, 3].

Ранее считалось, что нейроны МС регулируют моторику желудка и кишечника, а нейроны ПС - транспорт ионов и воды через эпителий кишечника, а также секреторную функцию желез. Однако в последние годы было установлено, что связи сплетений являются более сложными. Доказано, что нейроны внешнего слоя ПС могут посылать волокна к циркулярным гладким мышцам, участвуя тем самым в регуляции моторики кишки, а также к нейронам симпатических превертебральных узлов [4].

Гистоархитектоника ганглиев МС и ПС животных различных видов в современной литературе изучена достаточно подробно [5-7]. Применение современных методов исследования, включая иммуногистохимические, позволило качественно и количественно охарактеризовать морфологию узлов различных отделов пищеварительной системы [8, 9].

В ходе постнатального развития происходит увеличение размеров нейронов узлов автономной нервной системы, изменение их нейрохимических характеристик [10-12]. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что к моменту рождения ПС у грызунов отсутствует, и его формирование происходит после рождения [13, 14].

Тем не менее, имеющиеся количественные данные относительно формы и площади узлов, числа нейронов в узлах, размеров нейронов у животных различных возрастных групп от момента рождения до наступления старости являются неполными и отрывочными.

Цель

Целью исследования явилось исследование морфометрических особенностей интрамуральных узлов МС и ПС тонкой и толстой кишки крысы в постнатальном онтогенезе.

Материалы и Методы

Дизайн исследования

Проведено экспериментальное одноцентровое сплошное неконтролируемое неослеплённое исследование.

Работа выполнена на крысах различных возрастных групп: новорожденных, 10-, 20-, 30-, 60-суточных, 24-месячных крысах (по 5 в каждой возрастной группе). Эксперименты проводились в соответствии с отечественными и международными положениями о гуманном обращении с животными. Эвтаназию животных осуществляли летальной дозой уретана (3 г/кг, внутрибрюшинно).

Процедура иммуногистохимического анализа подробно описана в наших предыдущих работах [15]. Животных перфузировали вначале раствором стандартного фоcфатно-cолевого буфеpа (PBS), затем 4% pаcтвоpом паpафоpмальдегида на PBS. После перфузии участки двенадцатиперстной кишки и поперечной ободочной кишки длиной 0,5 см и извлекались и дофиксировались в той же смеси в течение 1-2 часов. Полученный материал разрезался вдоль оси кишки и расправлялся. На криостате изготавливались серийные продольные срезы толщиной 12 мкм.

Для выявления нервных структур использовался универсальный нейроиммуногистологический маркёр - протеиновый генный продукт 9,5 (PGP 9.5) [8, 9]. Использовались первичные антитела морской свинки к PGP9.5 (Abcam, США, разведение 1:200). Вторичные  антитела были конъюгированы с флюорохромом - индокарбоцианином (Cy3, Jackson, США, разведение 1:100), дающим красную флюоресценцию.

Визуализацию препаратов на флуоресцентном микроскопе Olympus BX43 с соответствующим набором светофильтров (Япония). Фотографирование проводили с использованием цифровой CCD камерой Tucsen TCC 6.1ICE c программным обеспечением ISCapture 3.6 (Китай). Размеры отдельных нейронов и узлов определяли при помощи некоммерческой программы Fiji (Версия 2.11.0, США). Только нервные клетки, содержащие ядро, были включены в анализ. При отборе полей зрения для микрофотографирования использовался метод наименьших квадратов [16].

 

Этическая экспертиза

На проведение исследования получено разрешение Этического комитета Ярославского государственного медицинского университета (№ 29 от 21.02.2019 г.).

Статистический анализ

Размер выборки рассчитывался на основании ресурсного уравнения по Mead [17], где число животных для каждого возраста считали равным 5. Использовался метод многоэтапной гнездной выборки, при котором подсчет производился на 5 ганглиях в каждом из 5 срезов каждого из 5 животного для каждого сплетения, отдела кишечника и возраста [16].

Статистический анализ данных и построение графиков проводился с использованием программ Sigma Plot (Systat Software, США) и GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Проверка выборки на нормальность осуществлялась с использованием теста Шапиро-Уилка. Для нормального распределения величины представлены как средняя арифметическая ± стандартное отклонение, М±SD (n), где n - число значений, использовавшихся для подсчета среднего. Для оценки различий между разными группами использовали непарный параметрический one-way ANOVA тест. За уровень статистической значимости был взят p<0,05.

Результаты

Нейроны, содержащие универсальный нейроиммуногистологический маркёр PGP9.5, обнаруживались в тонкой и толстой кишке в МС и ПС с момента рождения и на протяжении всех исследованных периодов.

У всех животных ганглии МС в тонкой кишке были расположены параллельно, тогда как в толстой кишке предпочтительной ориентации ганглиев не отмечено. Ганглии МС были соединены между собой короткими пучками нервных волокон (рис. 1). Ганглии ПС были меньше по размерам, имели звездчатую неправильную форму и соединялись более тонкими пучками волокон (рис. 2).

У новорожденных крыс число ганглиев на 1 мм длины тонкой и толстой кишки было максимальным, а площадь ганглиев минимальной. В постнатальном онтогенезе происходило снижение числа ганглиев на 1 мм длины и увеличение площади ганглиев тонкой и толстой кишки в обоих сплетениях (рис. 3, 4).

Средняя площадь узлов МС возрастала с момента рождения до 60 суток жизни от 3865±335 до 8388±973 мкм² (тонкая кишка) и от 3657±283 до 7758±871 мкм² (толстая) и далее достоверно не изменялась (рис. 3). Не было выявлено достоверных различий между данным параметром в тонкой и толстой кишке (p>0,05).

В ПС тонкой и толстой кишки средняя площадь узлов также возрастала с момента рождения до 30 суток жизни от 520±137 до 1956±564 мкм² (тонкая кишка) и от 240±33 до 871±67 мкм² (толстая), после чего оставалась неизменной (рис. 3). Тем не менее, она была в несколько раз меньше по сравнению с МС в каждой возрастной группе. При этом средняя площадь узлов ПС в толстой кишке была достоверно меньше по сравнению с тонкой во всех возрастных группах (p<0,05).

В МС средняя плотность расположения узлов на 1 мм² площади уменьшалась в тонкой и толстой кишке (рис. 4). При этом в тонкой кишке уменьшение плотности происходило с момента рождения (54±6,2) до 60 суток (13±2,3), а в толстой – от момента рождения (64±6,2) до 12 месяцев жизни (15±2,1). Не было отмечено достоверной разницы по этому показателю между различными возрастными группами за исключением 60 суток, где средняя плотность расположения узлов на 1 мм² площади была достоверно выше в толстой кишке (p<0,05).

В ПС значение данного параметра также снижалось в первые 60 суток жизни от 348±45,1 до 61±6,4 (тонкая кишка) и от 276±38,3 до 81±9,1 (толстая). При этом в первые 10 суток жизни не наблюдалось достоверной разницы по этому показателю между тонкой и толстой кишкой. В то же время, начиная с 20 суток жизни и до старости плотность расположения узлов была выше в толстой кишке по сравнению с тонкой (p<0,05).

Среднее число нейронов в одном узле в МС было постоянным в постнатальном онтогенезе и не отличалось между различными возрастными группами, а также тонкой и толстой кишкой, при этом значение варьировали между 19±2,7 и 22±2,8 (рис. 5). Однако в ПС всех крыс в одном узле в среднем выявлялось меньшее число нейронов по сравнению с МС. При этом в ПС новорожденных крысят выявлялось меньше нервных клеток в одном узле (6±0,6 в тонкой и 7±0,5 в толстой кишке) по сравнению с 10-суточными крысятами (11±2,1 в тонкой и 12±2,8 в толстой кишке) (p<0,05). Далее количество нейронов в ПС между 10-суточными и более взрослыми животными в обоих отделах кишечника достоверно не отличалось (p>0,05).

Средняя площадь сечения нейронов возрастает с момента рождения до 60 суток жизни в МС и ПС тонкой и толстой кишки (рис. 6). Между данными показателями в тонкой и толстой кишке не было отмечено достоверных отличий. При этом начиная с 10-суточного возраста до 60 суток, средняя площадь сечения нейронов МС становится достоверно большей по сравнению с ПС (p<0,05). У старых крыс в ПС средняя площадь сечения нейронов опять возрастает по сравнению с предыдущими возрастными группами.

 

Обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют, что у крысы МС и ПС тонкой и толстой кишки присутствуют к моменту рождения. В постнатальном онтогенезе происходит увеличение размеров нейронов, а также самих узлов МС и ПС. В МС число нейронов в узле не меняется после рождения животного, в то время как у крыс число нейронов ПС достоверно увеличивается в первые 10 суток жизни.

В отличие от прежних представлений [13, 14], нам удалось доказать наличие сформированного ПС уже у новорожденных крыс. Тем не менее, средняя площадь ганглиев и число нейронов в узле ПС меньше по сравнению с МС в каждой возрастной группе. При этом число нейронов в ПС возрастает в первые 10 суток жизни и далее достоверно не меняется.

Площадь узлов возрастает, а плотность нейронов и ганглиев на единице площади кишки снижается в раннем постнатальном онтогенезе, что соответствует литературным данным [18, 19]. Тем не менее, имеются противоречивые данные относительно изменения числа нейронов и плотности узлов на срезах у старых животных. Ряд авторов утверждает, что при старении происходит уменьшение числа нейронов, прежде всего в узлах МС [20, 21]. Результаты нашего исследования, а также данные других источников [7, 22] свидетельствуют, что значимого снижения числа нейронов в узлах при старении не происходит. Вероятно, различия между источниками можно объяснить видовыми различиями и особенностями примененных методик. Также есть данные, что при старении не происходит снижения общего числа нейронов, а происходит изменение нейрохимического состава. Например, уменьшается доля холинергических нейронов, но возрастает процент клеток, экспрессирующих нейрональную синтазу оксида азота [23, 24].

Размеры нейронов увеличиваются в раннем постнатальном онтогенезе в первые два месяца жизни в МС и ПС. Интересно, что у старых крыс размеры нейронов в МС остаются постоянными, но возрастают в ПС. Имеющиеся литературные данные на этот счет противоречивы [20, 21].

Заключение

В постнатальном онтогенезе в первые 30 суток жизни происходит увеличение размеров узлов МС и ПС и снижение плотности их расположения на единицу поверхности тонкой и толстой кишки. Форма узлов и число нейронов в узлах МС в постнатальном онтогенезе не меняется. Ганглии ПС, в отличие от МС тонкого и толстого кишечника крыс к моменту рождения являются незрелыми. Формирование гистотопографии сети узлов ПС происходит в первые 10 суток жизни. Таким образом, развитие МС и ПС кишечника происходит неравномерно по темпам и срокам, что нужно учитывать в экспериментальной практике, а также разработке новых лекарственных препаратов для гастроэнтерологии в педиатрии.

 

 

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: П.М. Маслюков — разработка концепции и дизайна, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; А.Ф. Будник — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и  написание текста статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

作者简介

Petr Masliukov

Yaroslavl State Medical University

Email: mpm@ysmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-6230-5024

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии с биофизикой

俄罗斯联邦, 150000, Ярославская область, г. Ярославль, ул. Революционная, 5

Antonina Budnik

Kabardino-Balkarian State University named after H.M. Berbekov

编辑信件的主要联系方式.
Email: budnik74@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3333-5865

Кандидат медицинских наук, доцент. Медицинская академия, кафедра нормальной и патологической анатомии человека

俄罗斯联邦, Россия, г. Нальчик, ул. Чернышевского, 173

参考

补充文件