DETECTION OF MORPHOLOGICAL SIGNS OF MAST CELL DEGRANULATION IN HUMAN CHOROID PLEXUS USING DIFFERENT STAINING METHODS AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY

全文:

Чные клетки (ТК) - это клетки соединительной ткани, которые участвуют в иммунной защите организма и аллергическом воспалении, а также контролируют локальную гемодинамику и целостность тканевых структур [5]. Отличительной особенностью этих клеток является наличие плотных гранул, заполняющих до 40 % цитоплазмы, в которых хранятся синтезируемые ими биогенные амины (гистамин и серотонин), цитокины, ферменты (триптаза, химаза, кислые гидролазы и ряд других), простагландины, лейкотриены, аденозинтрифосфат, нейропептиды (вазоинтестинальный пептид и гонадотропинрилизинг-гормон) [2]. ТК происходят от плюрипотентных стволовых клеток костного мозга, откуда распространяются по всему организму, где в местах окончательной локализации завершается их дифференцировка. Они присутствуют почти во всех органах и тканях (за исключением костной и хрящевой ткани). ТК до последнего времени стандартно выявляются с помощью окрашивания катионными тиазиновыми красителями [6, 8], такими как тионин, толуидиновый синий, азур А, благодаря эффекту метахромазии - окрашиванию в цвет, отличный от цвета самой краски. Метахромазия проявляется при связывании красителя с содержащимися в тучных клетках протеогликанами (в первую очередь, гепарином и хондроитинсульфатом). В центральной нервной системе с помощью данного метода тучных клеток долгое время выявить не удавалось. Лишь к 1920-м годам ТК были описаны в сосудистом сплетении мозга некоторых животных, а в отдельных структурах мозга (гипоталамусе, таламусе, поводке, а также мозговых оболочках) они были обнаружены только в 1960-1970-е годы [12]. При активации ТК под действием иммунных механизмов (IgE-зависимых и IgE-независимых), а также внешних и внутренних химических факторов (гормоны, тканевые протеазы, токсины) содержимое клеток выбрасывается путём экзоцитоза - процесса, который в данном случае называется дегрануляцией [18]. Биоактивные компоненты гранул при дегрануляции оказывают локальное действие на близлежащие клетки, в первую очередь - на клетки сосудистой системы [14], а в головном мозгу - в том числе на нервные и глиальные клетки [9], что определяет реакцию ткани головного мозга на повреждающие факторы. Таким образом, тучные клетки (в кооперации с глиальными и нервными клетками) участвуют в развитии нейровоспаления, которое, как установлено в последнее время, лежит в основе или, по меньшей мере, сопровождает практически все нейродегенеративные и многие психические заболевания [11]. Вследствие этого большое значение имеют методические подходы к выявлению и описанию тучных клеток в головном мозгу и их дегрануляции. Цель настоящего исследования состояла в определении возможностей выявления признаков дегрануляции тучных клеток сосудистого сплетения головного мозга человека при использовании окраски толуидиновым синим, гистохимической реакции на аминогликозогликаны и сульфаминогликаны и иммуногистохимической (ИГХ) реакции на триптазу тучных клеток. Материалом для исследования служили фрагменты сосудистого сплетения головного мозга 29 людей в возрасте 14-73 года из архива отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Соблюдение этических норм при архивации биологического материала подтверждается положительным заключением локального этического комитета ИЭМ № 58-9/1-684 от 11.12.2009 г. Материал был фиксирован в этаноле и смеси спирта и формальдегида, обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 6-7 мкм. Для оценки присутствия и локализации тучных клеток часть препаратов окрашивали толуидиновым синим (BioVitrum, Россия) и альциановым синим (BioVitrum, Россия) с докраской 0,5 % раствором ядерного прочного красного (Nuclear Fast Red, Sigma Aldrich, США). Дополнительно были проведены ИГХреакции с использованием антител к триптазе ТК человека (мышиные моноклональные - клон AA1), разведение производителя (BioGenex, США). В качестве вторичных антител использовали набор MACH2 Universal HRP Polymer Kit for mouse and rabbit (Biocare Medical, США). Для визуализации продукта ИГХ-реакции применяли 3΄3-диаминобензидин (набор реагентов DAB+, Dako, Дания). Просматривали не менее 10 срезов в каждом из случаев. Выявляли ТК с выраженной грануляцией (наличие плотно расположенных цитоплазматических гранул) и ТК с дегрануляцией (частичное опустошение цитоплазмы и выход отдельных гранул за ее пределы). Анализ полученных препаратов и фотосъемку выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и цифровую фотокамеру ICC50 (Leica, Германия). Подсчет ТК производили на препаратах, окрашенных альциановым синим и ИГХ-методом. Определяли количество ТК на последовательных срезах одного и того же случая, окрашенных альциановым синим или ИГХ на триптазу, и вычисляли соотношение количества ТК, выявляемых после двух разных способов окраски. При проведении ИГХ-реакции оценку степени дегрануляции ТК производили по площади ореола (продукт иммуногистохимической реакции к триптазе) вокруг ТК. Измерения осуществляли в программе ImageJ (NIH, США). Для каждого случая анализировали по 5-10 клеток. Сравнение данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Исследование 29 образцов сосудистого сплетения мозга человека после их окраски толуидиновым синим и альциановым синим показало, что в 13 случаях (45 %) ТК выявить не удалось. Вследствие этого для дальнейшего изучения были использованы только образцы ткани с обнаруженными ТК (16 наблюдений). При окраске препаратов толуидиновым синим в сосудистом сплетении встречались единичные метахроматически окрашенные ТК. Они были полиморфными, имели круглую, реже вытянутую форму. Для них характерно наличие отчётливо видимых гранул, заполняющих всю цитоплазму (рисунок, а). Дегранулирующие ТК выявлялись редко (см. рисунок, б). При окраске альциановым синим в сосудистом сплетении идентифицировали значительно больше ТК. ТК без признаков дегрануляции имели четкие границы (см. рисунок, в), а при дегрануляции клетки границы цитоплазмы неотчётливы, при этом наблюдались группы гранул, расположенных вне цитоплазмы ТК. Цитоплазма дегранулирующих ТК заметно светлее, чем у клеток без дегрануляции (см. рисунок, 1). При подсчете ТК на препаратах, окрашенных альциновым синим, на долю клеток без дегрануляции приходилось 40 %, а с дегрануляцией - 60 %. ИГХ-реакция на триптазу визуализирует существенно больше ТК в сосудистом сплетении, чем после окраски альциановым синим. Нередко в одном поле зрения видны по несколько триптазо-иммунореактивных клеток, при этом неспецифического окрашивания ткани сосудистого сплетения не наблюдалось. Обращает на себя внимание частая встречаемость ТК в непосредственной близости к сосудам (см. рисунок, е). Дегранулирующие ТК имели более слабое ИГХокрашивание (см. рисунок, е), чем недегранулирующие (см. рисунок, д), и находились в окружении слабоокрашенной области с размытыми границами (своего рода «ореол»). Было выявлено, что доля клеток без дегрануляции составляла 45 %, с дегрануляцией - 55 %. При подсчёте ТК при ИГХ-реакции выявлялось в 3,5 раза больше клеток (максимум 46 клеток на одном препарате), чем после окраски альциановым синим (максимум - 12 клеток на одном препарате). В среднем, альциановый синий выявлял 35 % от количества ТК, определяемых с помощью ИГХ-реакции на триптазу. Было обнаружено, что размеры ТК в процессе дегрануляции (84,0±7,4 мкм²) и в состоянии покоя (88,3±15,1 мкм²) значимо не различались (p<0,5). Площадь образующегося «ореола» при дегрануляции примерно в 9 раз превышает размеры самой клетки (740,4±21,3 мкм²). Интересно отметить, что, несмотря на разное число выявляемых ТК при ИГХ-реакции и окраске альциановым синим, соотношение ТК с признаками дегрануляции (55-60 %) и без дегрануляции (40-45 %) было одинаковым. В ходе предварительного исследования в 45 % анализируемых образцов сосудистого сплетения нам не удалось выявить ТК при использовании не только толуидинового синего, но и альцианового синего, который в целом позволяет выявить большее число ТК, чем толуидиновый синий. Ранее нами также было продемонстрировано, что ТК не удаётся выявить в сосудистом сплетении у 60-63 % детей и 20 % взрослых [3, 4]. Другими исследователями в работе, проведённой на области мозга человека, называемой самым задним полем (area postrema), эти клетки также не выявлялись в 31 % препаратов, окрашенных толуидиновым синим, в 25 % - альциановым синим ив 10 % препаратов с ИГХ-реакцией на триптазу [16]. Эти данные указывают на особую сложность выявления ТК, особенно в центральной нервной системе, на неоднозначность результатов, получаемых разными методами, и важность нахождения наиболее эффективных и адекватных методов выявления ТК и их дегрануляции. В настоящем исследовании были использованы три метода идентификации ТК: классический метод окраски толуидиновым синим (визуализация опосредуется за счёт их метахромазии), гистохимическое окрашивание на гликозаминогликаны и сульфаминогликаны с помощью альцианового синего и ИГХ-реакцию на триптазу - фермент, характерный для ТК. Все три метода с разной степенью эффективности выявляли данный тип клеток в сосудистом сплетении человека. Наилучшие результаты были получены при использовании ИГХ-реакции на триптазу, тогда как меньше всего ТК выявлялось при окраске толуидиновым синим. Полученные нами результаты сходны с данными исследования ТК в самом заднем поле (area postrema) человека. В желудке, тонкой кишке и печени человека ИГХреакция на триптазу позволяла выявить вдвое больше ТК, а в коже - на 40 % больше, чем окраска толуидиновым синим [7]. При выявлении двух фенотипов ТК - слизистых оболочек и соединительнотканных - было показано, что ИГХреакция на триптазу в желудке мыши выявляет вдвое больше слизистых оболочек ТК по сравнению с окраской толуидиновым синим. Однако выявляемость соединительнотканных ТК в желудке и коже мыши, а также в желудке и печени монгольской песчанки была одинаковой при использовании обоих методов, а в тонкой кишке монгольской песчанки эффективность выявления ТК была одинаковой при использовании толуидинового синего, альцианового синего и ИГХ-реакции на триптазу [1, 7]. Сопоставление полученных нами результатов и данных из приведённых выше работ свидетельствует о сходстве гисто-и ИГХ-характеристик ТК разных структур мозга и желудочно-кишечного тракта человека и различии с ТК других видов животных, у которых наблюдается вариативность химических характеристик ТК разных органов, что согласуется со сведениями о значительной гетерогенности популяции ТК - как межвидовой, так и межорганной в пределах одного вида. Эти различия связаны со значительными отличиями биохимических, гистохимических и функциональных характеристик разных видов ТК [17]. Этот факт свидетельствует о необходимости соблюдать осторожность при попытках механически экстраполировать какие-либо данные о ТК, полученные на одном виде организмов, на другие виды, а в пределах одного вида - данные, полученные на одних органах и тканях, - на другие органы и ткани. Независимо от метода, которым выявлялись ТК, в них визуализировались многочисленные гранулы. Большое число ТК (55-60 %) в сосудистом сплетении мозга человека были зафиксированы в состоянии дегрануляции - выделения их содержимого. При этом окрашенные толуидиновым синим или альциановым синим гранулы расположены вблизи ТК, но за пределами их цитоплазмы либо в случае ИГХ-реакции на триптазу - окрашенной области вокруг ТК, в которой нередко видны тёмноокрашенные гранулы. В литературе описаны определённые критерии, с помощью которых на препаратах, окрашенных толуидиновым синим, отличают дегранулирующие ТК от гранулированных. Помимо наблюдаемых около ТК гранул, особое внимание обращается на то, имеются ли в цитоплазме клеток гранулы, отчетливо отделенные друг от друга. Это расценивается как показатель дегранулирующих клеток. Невозможность обнаружения отдельных гранул внутри ТК из-за их плотной упаковки расценивается как показатель гранулированной клетки [15]. Нельзя не признать, что определение дегранулирующих ТК с помощью ИГХ-реакции на триптазу значительно более наглядно и удобно для исследования. В полученных нами данных обращает на себя внимание значительная доля дегранулирующих ТК в сосудистом сплетении мозга человека. Известно, что, помимо дегрануляции, вызванной определёнными стимулами, существует так называемая постепенная дегрануляция ТК («piecemeal degranulation»), которая была описана для ТК разных органов и у разных видов животных [10, 13]. По-видимому, тот факт, что наблюдаемые нами ТК в сосудистом сплетении человека в большинстве своём находятся в состоянии дегрануляции, свидетельствует именно о таком характере выделения продуктов ТК, которые оказывают перманентное влияние на окружающую ткань сосудистого сплетения, регулируя его функциональную активность. Суммируя полученные результаты, следует подчеркнуть, что выявление ТК в сосудистом сплетении мозга человека, как и в целом в центральной нервной системе, а также в других органах, представляет собой сложную задачу. Использованные нами три метода окраски позволили с разной степенью эффективности выявить ТК сосудистого сплетения. Полученные данные свидетельствуют, что наилучшим методом визуализации ТК сосудистого сплетения и процесса их дегрануляции является ИГХ реакция на триптазу в сравнении с окраской толуидиновым синим и альциановым синим. Обнаружение преимущественно дегранулирующих ТК свидетельствует о том, что дегрануляция ТК в сосудистом сплетении мозга человека относится к разновидности постоянной дегрануляции, перманентно влияющей на функциональную активность сплетения и более широко - на проницаемость гематоликворного барьера в целом. Вклад авторов: Концепция и дизайн исследования: Д. Э. К. Сбор и обработка материала: Е. А. Ф., М. А. С., Д. А. С., А. Д. Н. Статистическая обработка данных: И. П. Г., Д. А. С. Анализ и интерпретация данных: Д. Э. К., И. П. Г. Написание текста: И. П. Г., Е. А. Ф., Д. А. С., Д. Э. К. Авторы сообщают об отсутствии в статье конфликта интересов.

作者简介

Ye. Fyodorova

Institute of Experimental Medicine

Email: iemmorphol@yandex.ru
Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

I. Grigoriyev

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

M. Syrtzova

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

D. Sufiyeva

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

A. Novikova

Institute of Experimental Medicine

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

D. Korzhevskiy

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

Laboratory of Functional Morphology of the Central and Peripheral Nervous System; Department of Fundamental Problems of Medicine and Medical Technology, Faculty of Dentistry and Medical Technologies 12 Akademika Pavlova Str., St. Petersburg, 197376

参考

补充文件